| 研究課題/領域番号 |
17K07396
|
|---|
| 研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
|---|
研究代表者 |
上村 陽一郎 国立研究開発法人理化学研究所, 生命機能科学研究センター, 上級研究員 (20321599)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2021-03-31
|
| キーワード | 走化性 / 三量体Gタンパク質 / 三量体Gタンパク質シャトリング / Gip1 / 細胞性粘菌 |
|---|
| 研究実績の概要 |
ヒトの白血球や細胞性粘菌のような走化性細胞はわずか１%程度の濃度勾配を１０万倍もの濃度域に渡り検出する能力を持つ。本研究では、申請者が見出した走化性のダイナミックレンジを広く維持する三量体Ｇタンパク質シャトリングに注目する。このような制御にはGip1とＧタンパク質の複合体形成が重要な役割を果たす。細胞質に局在するGip1はＧタンパク質の結合因子として同定されてきた。しかし、どのようにして疎水的な脂質修飾を持つＧタンパク質が親水的な環境である細胞質でGip1と複合体形成できるかは不明であった。
「Gip1とＧタンパク質の結合様式」についてすでに、Gip1のＧタンパク質結合領域について結晶構造の解明に成功した。Gip1は６つのアルファヘリックスを持ち、それらが疎水性の穴を形成していた。この穴には大量精製に用いた大腸菌由来の脂質分子がはまっていた。この事実と生化学的な解析結果から、三量体Gタンパク質のガンマサブユニットに修飾されたゲラニルゲラニル基がこの疎水性の穴を介して結合していると結論した。「Gip1とＧタンパク質の結合サイクル」を理解するためには、Gip1に脂質がはまっていないアポ体の構造を理解する必要がある。そこで本年度は、Gip1について無細胞タンパク質合成系を利用し、細胞由来の脂質の影響を回避したタンパク質の調整を試みた。その結果、スモールスケールでの発現と部分精製に成功した。現在、この条件をラージスケールのタンパク質精製に拡張し、結晶構造解析に進める準備をおこなっている。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度の研究計画では「Gip1とＧタンパク質の結合サイクル」を理解することを目標とした。そのため、新たにGip1のアポ体の結晶構造を解くこととした。発現細胞からの脂質の影響を避けるため無細胞タンパク質合成系によるGip1の発現を試みた。現在、小スケールでの発現確認とGip1タンパク質に付加したタグによる精製をおこない、予定通りタンパク質の部分精製が終了した。
|
| 今後の研究の推進方策 |
「Gip1とＧタンパク質の結合サイクル」を理解するためには、Gip1のアポ体の構造を理解する必要がある。すでに小スケールでのGip1の無細胞タンパク質合成系を利用した発現と、付加タグによる部分精製を終了している。今後は、この系をスケールアップし、タンパク質結晶を得るために必要な量とその条件を検討する。結晶ができた際はSPring8でX線照射をおこない回折データを取得し、すでに獲得している脂質を含んだGip1構造の分子置換法により構造モデルを作成する。
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
本研究では走化性ダイナミックレンジ拡張に必須のGタンパク質シャトリングの分子基盤を明らかにすることである。今回、この制御に関与するGip1の立体構造をX線結晶構造解析により明らかにし、Gタンパク質との結合様式に関する仮説を構築した。本研究自体は予想より早く進行したが、Gタンパク質シャトリングサイクルの完全な理解には、Gip1のアポ体の構造が必要であることがわかった。そこで、この追加実験を進めるための研究費を次年度に繰り越すこととした。
|
