| 研究課題/領域番号 |
17K07398
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| 研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
森島 信裕 国立研究開発法人理化学研究所, 伊藤ナノ医工学研究室, 特別嘱託職員 (40182232)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 筋分化 / 小胞体ストレス / カルシウムストア |
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| 研究実績の概要 |
骨格筋は前駆細胞である筋芽細胞が融合してつくられる。この過程において小胞体からカルシウムが漏出してカルシウム枯渇が起こり、その結果生じる生理的な小胞体ストレスが筋分化にとって必須であることを私たちは以前見出した。本研究は、筋芽細胞株を用い、カルシウム枯渇が引き起こされるメカニズムを分子レベルで明らかにすることを第一の目的とする。また、小胞体内から細胞質ゾルへ出たカルシウムが起動するシグナル伝達系を同定し、それが筋分化過程において果たす役割を示す。本研究は、生理的な小胞体ストレスが生じるメカニズムの分子基盤を解明するとともに、筋分化過程におけるカルシウムシグナル系起動の仕組みを明らかにすることを目指している。
小胞体カルシウム枯渇を詳細に調べるため、枯渇開始時期の特定を試みた。小胞体カルシウムセンサーSTIM1が小胞体内腔のカルシウム濃度低下に応答して凝集することを利用し、STIM1-GFP（緑色蛍光タンパク質）を筋芽細胞で安定的に発現させてカルシウム濃度モニターとした。その結果、分化誘導開始後、22から24時間頃の間に凝集が検出され、この時期がカルシウム濃度低下の時期と特定できた。同じ時期に細胞質ゾルのカルシウム応答性プロテアーゼ（カルパイン）の活性化について検討した。カルパインによって効率的に切断されることが知られている細胞骨格タンパク質、フォドリンの切断がこの時期に活発になっていることが分かった。同時に、本研究課題の柱の一つであるBcl-2の挙動についても検討し、ほぼ同じ時期に急激な発現上昇が起こることが示された。Bcl-2が筋分化において果たす役割を調べるため、Bcl-2 shRNAを恒常的に発現する筋芽細胞を作製した。shRNAは３種類設計し、筋芽細胞に一過的に導入した時に最も遺伝子発現抑制効果の高いものを選択して安定発現株の作製に用いた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当初の計画におおむね沿って実験を行うことができ、目標としていた小胞体カルシウムセンサータンパク質STIM1の凝集を指標としたカルシウム枯渇開始時期の特定ができた。また、この裏付けとして、同じ時期に細胞質ゾルではカルシウムによりカルパインの活性化を検出することもできた。さらに、Bcl-2タンパク質の量的変化について再現性のある結果が得られている。Bcl-2 shRNAの安定発現株を作製することができ、分化条件下でその挙動を解析する準備が整った。
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| 今後の研究の推進方策 |
細胞株作製などの準備がおおむね順調に進んだため、今後も計画通り、小胞体から放出されたカルシウムが細胞質ゾル中のカルシウム依存性タンパク質に与える影響と筋分化過程への関わりについて解析を進めていく。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
物品費使途の中で割合が大きい抗体の購入が計画通りには進まなかったため。研究の性格上、特異性が高く、高感度の検出を可能とする抗体を使用する必要があり、選別を慎重に行った。無料サンプル品の試用や、抗体を用いるのに適した実験試料の作製などを通して検討を進めてきたが、対象タンパク質の中には優良な抗体の選別に時間がかかったものがあった。こうした検討をもとにして次年度に抗体購入を実施する予定であり、助成金は適正に使用される。
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