| 研究課題/領域番号 |
17K07401
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| 研究機関 | 国立研究開発法人国立循環器病研究センター |
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研究代表者 |
山崎 泰男 国立研究開発法人国立循環器病研究センター, 研究所, 室長 (30308621)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 血管内皮細胞 / オルガネラ形成 / 細胞内輸送 / 細胞極性 |
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| 研究実績の概要 |
血管内皮細胞は血管の内腔を覆う単層細胞である。血管内は、血液の円滑な体内循環のため、通常抗血栓的な環境に保たれていている。一方、血管外は血管の損傷などによる出血に備えるため、血栓形成に促進的な環境に保たれていると考えられている。すなわち血管内皮細胞は、相反する二つの環境に面する細胞である。したがって本細胞から分泌される因子の細胞内輸送は厳密に制御されるべきである。von Willebrand因子（VWF）は血管内皮細胞で合成される血漿タンパク質の一つで、血小板を血管内皮細胞上に粘着させることで止血を行う。VWFは、Weibel-Palade小体（WPB）と呼ばれる血管内皮細胞に特異的なオルガネラに貯蔵され適時分泌される。本研究課題では血管内皮細胞からのVWFの分泌メカニズムを、特に細胞極性およびオルガネラpHの視点から明らかにすることを目的として研究を進めている。初年度にあたる本年度は、適正な培養条件の設定からはじめた。細胞極性を視野に入れるため、まずHUVECの極性化培養条件を検討した。その結果、臍帯静脈内皮細胞HUVECをフィブロネクチンコート上で5-７日程度培養すると、細胞間にタイトジャンクションおよびアドヘレンスジャンクションを形成することが判明した。すなわち生体内の血管内皮細胞と同様の細胞結合を有する培養条件を確立できたと考えた。常法で培養したHUVEC（極性化していない）にはVWFは一様には発現しないが、本条件で培養すると全ての細胞にVWFが均一に発現した。生体内の血管内皮細胞は一様にVWFを発現していることから、本条件で培養された極性化HUVECは生理的な血管内皮細胞に近い性質を示すと考えられた。すなわち細胞極性とVWFの発現には相関があると考えられるので、さらなる詳細な機構を検討すると共に、今後はオルガネラpHとVWFの分泌の関係について研究を進めている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
初年度にあたる本年度は、まず細胞培養系など実験系の確立を行った。血管内皮細胞は高密度に培養すると敷石状の単層構造を形成することが知られている。種々の培養条件を調べた結果、フィブロネクチンコート上で5-7日間培養すると敷石状の細胞構造を形成することが位相差顕微鏡で確認できた。同条件においてZO-1、VE-Cadherin、PECAM-1は各細胞間に適正に配置されることから、生体の血管内皮細胞と同様のタイトジャンクションおよびアドヘレンスジャンクションを形成しているものと考えられる。生体内の血管内皮細胞は一様にVWFを発現していることから、VWFは血管内皮細胞のマーカーとして用いられる。血管内皮細胞を常法で比較的低密度に培養すると、VWFの発現量は一様でなく、細胞によっては発現が見られない。一方、本条件で培養すると細胞が一様にVWFを発現することから、本条件で培養した血管内皮細胞は、通常培養した細胞に比べて、より生理的な性質を示すと考えられる。細胞極性がVWFの発現に影響すると考えられるので、その詳細なメカニズムの解明を目標に研究を進めている。今後はVWFの分泌方向に対する影響の有無についても検討する予定である。
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| 今後の研究の推進方策 |
VWFを均一に発現する細胞群を得られる条件が判明したので、同条件で今後の実験を行う。血管内皮細胞においてERで合成されたVWFポリペプチド鎖は、ゴルジ体でジスルフィド結合によってマルチマー化したのち、Weibel-Palade小体（WPB）貯蔵される。WPBはpH5.4の酸性オルガネラである。その酸性環境から血液中（pH7.4）へ放出されることで、VWFは分子構造を紐状に展開し、効率的に血小板粘着部位を血管内皮細胞上に形成すると考えられている。またin vitroの実験系ではあるが、VWFのマルチマー化は酸性下でのみ進行することが報告されている。すなわちWPBの酸性環境はVWFの機能に重要であると考えられるが、いかなる分子がWPBの酸性環境を形成・維持しているかについては全く明らかにされていない。そこで本研究課題では細胞極性に加えて、WPBの酸性pHの形成・維持機構について明らかにすることを目的に研究を進める。細胞内オルガネラの酸性pHの形成・維持には種々の分子が関与することが明らかにされているので、イオントランスポーターやプロトンポンプなどをスクリーニングし、VWFの合成・細胞内輸送にかかわる新規分子の同定を試みる。スクリーニングは、化学阻害剤のほかsiRNAなどを用いて行う。評価は、細胞の蛍光染色のほか、ウェスタンブロッティングやマルチマー解析などの生化学的な手法を用いて定性的かつ定量的に行う。候補分子が得られたら、そのメカニズムの精緻化を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
次年度に依頼する予定のプロテオーム解析などの受託解析の費用が想定よりも高額になることが判明したため、今年度予算の一部を当該予算に充てることとした。試薬等の購入に際し、キャンペーン等を積極的に利用することで予定よりも支出を低く抑える努力をした。
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