| 研究課題/領域番号 |
17K07407
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| 研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
宮西 正憲 国立研究開発法人理化学研究所, 生命機能科学研究センター, 研究員 (80542969)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 造血幹細胞 / 自己複製能 / Hox遺伝子 |
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| 研究実績の概要 |
造血幹細胞（Hematopoietic stem cell: HSC）は、自己複製能と多分化能を有する血液細胞と定義づけられ、造血システムの頂点に位置する組織幹細胞である。造血システムの恒常性維持のため、HSCの一部は細胞分裂に伴い、その機能の一部を失いながら段階的に分化を続け、最終的には赤血球、血小板、白血球といった種々の成熟血液細胞となる。自己複製能と分化のバランスを保つことで、HSCは長期に渡り機能を維持したまま生存することができる。しかし、どのような機序で、このバランスが保たれているか、その詳細な分子機構は殆ど明らかになっていない。モノクローナル抗体とフローサイトメーターを用いて定義される従来のHSC（immunophenotypic HSC: pHSC）分画中に “自己複製能を長期に渡り有する長期造血幹細胞（Long-term HSC: LT-HSC）”と“自己複製能のみが減弱もしくは欠損した短期造血幹細胞（Short-term HSC: ST-HSC）”が混在することが、その要因の一つであることから、我々はこれまでに、LT-HSC特異的にマーキングする遺伝子としてHoxb5を同定、さらにこの遺伝子をレポーターとする遺伝子改変マウスを作製することで、LT-HSCのみを純化することに世界で初めて成功してきた。Hoxb5はマウス骨髄内において、LT-HSCのみに発現する遺伝子として初めて同定されたが、これまでにHSCの機能に関する報告はない。一方で、Hoxファミリー遺伝子の中には、造血能への関与が報告されている遺伝子も存在することから、Hoxb5が血液細胞、特に唯一発現の認められるLT-HSCの機能を制御している可能性は高い。そこで、本研究ではHoxb5遺伝子を中心に、LT-HSC分画における生物学的役割の解明を目標としている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
平成２９年度に、Hoxb5遺伝子が自己複製能を制御する遺伝子であることを実証したので、転写因子であるHoxb5遺伝子の下流で、どのような遺伝子群が実際に発現し、自己複製能を制御しているかを明らかにする必要がある。下流遺伝子の同定に、ChIP解析法を用いたスクリーニングを行うが、一般的にChIP解析には106-7程度の細胞数を要する。１匹あたり500-1000 LT-HSCしか採取出来ない技術的ギャップを埋めるため、高感度ChIPアッセイの開発を試みた。まず免疫沈降反応を至適化する目的で、Hoxb5-Flag融合蛋白を磁気ビーズと結合させたFlag抗体によって免疫沈降を行う方法やHoxb5-GFP蛋白をtargetにしたnano-bodyを用いて免疫沈降反応を試みた。その結果、蛋白の回収率としてはinput量の10%以下程度であった。ChIP-seqを103-4細胞で行うには、inputとして使用できるDNAがごく微量になる事が想定され、正確なデータを得るためにPCR biasが大きな障壁になると考えられる。このPCR biasを避けるため次世代シークエンス用Library合成時に、バーコード配列を持つoriginal tagを作製する事とした。具体的にはイルミナ社が公開しているtag配列であるP5, rP7配列をベースにindexに接する形でランダムな8塩基を挿入した。解析の際に重複したリードが見られた際、PCR biasの結果増幅しているのか(=挿入した8塩基が同一)、mRNAの量を反映して増幅しているのか(=挿入した8塩基が別)判断できるようにデザインした。更にそのtagを用いて次世代シークエンス用のライブラリーが作製可能である事を確認した。またHoxb5以外のファミリー遺伝子の機能をスクリーニングするためのライブラリーも現在作成中であり、順次機能解析を行っている。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成３１年度は、引続きマウスLT-HSCにおけるHoxファミリー遺伝子の機能解析を行う。
ChIPを用いた解析手法に関しては、ChIP反応後の転写因子の回収率が１０％以下となる原因に関してFormaldehyde固定によるタンパク変性による影響を考えており、disuccinimidyl glutarate等の試薬を検討し、ChIP-seq法各ステップの至適化による高感度化を継続して行う。Hoxファミリーによる機能制御機構の解明に関しては、バックアップとしてRNAseqデータを用いた遺伝子制御メカニズムの解明を検討している。具体的には、長期造血幹細胞、短期造血幹細胞等よりRNAを抽出し、オミクスデータを作成する。それらのデータを元に、パスウェイ解析等のBioinformaticsにてHox遺伝子による機能制御の解明を試みる。
また今年度はヒトサンプルを用いたヒトHSCにおけるHoxファミリー遺伝子の細胞生物学的意義に関して検討を行う。これまでヒトHSCはLineage-CD34+CD38-CD90+CD45RA-分画に存在すると言われてきたが、そのうちの何％が真のHSCに相当するのか全くの不明である。造血幹細胞を定義する細胞表面マーカーが動物種間が異なることがその要因の一つであり、転写因子等の種間を超えて機能が保存されている遺伝子による解析が必要である。Hoxファミリーは、種を越えて機能が保存していることが知られており、ヒト検体を用いて検討を行う。現在、近隣医療機関との連携を協議中であり、今年度中にヒト検体取得の体制構築が完了できる予定である。
完了次第ヒト造血幹細胞分画を用いたHox遺伝子発現、機能解析を開始予定である。
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