研究課題
(A)in vivoにおけるGUN1のDNA・RNAターゲットの探索、GUN1相互作用タンパクの同定・解析: GUN1-tagを発現するシロイヌナズナから 免疫沈降を行った。新たに作製したGUN1-tag発現株におけるGUN1タンパクの発現改善が認められたので、同条件での抽出、相互作用因子の検索を行っている。(B)gun1サプレッサー変異の単離・解析、プラスチド非依存的に光形態形成を行う突然変異体の単離・解析: (B-1)突然変異体の戻し交配F2植物からゲノムDNAを単離し、次世代シーケンサによる全ゲノムリシーケンスを行った。その結果、４つの変異株について原因遺伝子の候補が同定出来た。 候補遺伝子の破壊株を取得し、同様の表現型を示すか確認している。(B-2)gun1サプレッサーについて、戻し交配F2植物の同定を進めた。また、他のgun変異体との二重変異体を作製し、遺伝学的な相互作用を調べている。(C)シャジクモ類・蘚類・苔類・シダ類・裸子・被子植物GUN1オーソログの構造比較および、GUN1機能の保存性の解析、ゼニゴケ・ヒメツリガネゴケにおける GUN1機能の解析:シャジクモChara brauniiのGUN1オーソログ(CbGUN1)導入植物を作製した。また、CbGUN1とAtGUN1のキメラ遺伝子を作製し、形質転換体を得た。コレオケーテのGUN1オーソログクローンを作製中である。
3: やや遅れている
当初計画は、年度後半に起こったコロナウイルスの発生の影響で全体に遅延しているため、期間を延長して継続することにした。(A)GUN1相互作用因子の検索：新たにGUN1-tagタンパク質を高発現するトランスジェニックラインを作製し、前年度行った予備実験で分かった最適な条件で生育した植物からGUN1を抽出し、共免疫沈降するタンパクの検出を進めている。(B)GUN1ox株を親とするgun1様表現型を示す株の原因遺伝子の同定を進め、４株については候補遺伝子が明らかになった。野生型遺伝子を用いた相補実験や遺伝学的解析は順調に進展している。また、gun1変異のサプレッサースクリーニングについても、原因遺伝子の同定を進めている。おおむね予定通り計画が進行している。(C)シャジクモGUN1(CbGUN1)GUN1オーソログを導入したシロイヌナズナgun1変異体において、部分的な表現型の回復が見られた。現在、表現型の詳細な解析を進めている。
（A）共免疫沈降の実験を早急に進め、相互作用因子を同定する。また、植物内での一過的高発現システムを使って、GUN1タンパクを大量調製し、生化学的解析や新規高感度抗体の作製に用いる（B）原因遺伝子の同定を進め、同時に遺伝学的解析を進めることにより、シグナリングにおける作用点の解明を目指す。（Ｃ）シャジクモと近縁だが構造的に大きく異なるコレオケーテのGUN1をシロイヌナズナに導入し、表現型の解析を行う。シャジクモ類、苔類、種子植物のGUN1分子構造と機能の進化についてモデリングを行う。
GUN1高発現株の取得が困難だったことと、シャジクモGUN1遺伝子の同定に時間がかかったことで計画が遅延した。また、コロナウイルス対策で研究規模と時間に制限が加えられたため、当初計画の遂行が難しくなったため。次年度は、GUN1相互作用因子について質量分析を外注して行い、また突然変異の原因遺伝子同定については、全ゲノム配列リシーケンスを外注で行う。さらに、ウイルス感染リスクの低下が見込まれれば、海外における研究発表や共同研究を実施したい。
すべて 2020 2019 その他
すべて 国際共同研究 (2件) 雑誌論文 (1件) (うち国際共著 1件、 査読あり 1件、 オープンアクセス 1件) 学会発表 (2件) 備考 (1件)
Proc Natl Acad Sci U S A
巻: 116 ページ: 24900-24906
10.1101/532036
http://physiol2.bot.kyoto-u.ac.jp/HP3/
