| 研究課題/領域番号 |
17K07451
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| 研究機関 | 日本工業大学 |
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研究代表者 |
芳賀 健 日本工業大学, 基幹工学部, 准教授 (50382031)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 光環境応答 / 光順応性 / 光屈性 / シロイヌナズナ / 胚軸 / リン酸化制御 |
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| 研究実績の概要 |
植物は非常に広範囲な光条件に順応する機構を備えている。しかし、その分子メカニズムは未だに解明されていない。我々の研究グループは、青色光シグナル伝達因子であるNON PHOTOTROPISM HYPOCOTYL3 (NPH3)の機能制御にROOT PHOTOTROPISM2 (RPT2) が必須であり、その分子機構が植物の光順応に極めて重要であることを示した。本研究は、RPT2及びNPH3の機能に注目して研究を進めることで、植物の光環境順応メカニズムを解明することを目的として計画されている。
１）光屈性におけるNRLファミリーの働き
NPH3/RPT2 Like (NRL)ファミリーのなかで、RPT2と相同性の高いNRL18とNRL31の突然変異体を入手し、rpt2 変異体との二重変異体を作製した。特にNRL31は、NRL PROTEIN FOR CHLOROPLASTMOVEMENT1 (NCH1)として解析されており、葉緑体運動に関係することが報告されている重要なタンパク質である。今回、rpt2 nrl18 二重変異体とrpt2 nrl31 二重変異体を分離することができた。現在、それらの二重変異体について、胚軸の光屈性を中心に詳細な生理学的解析を行っている。
２）青色光によるNPH3のリン酸化制御の生理学的意味について
前年度の研究により、青色光照射によって脱リン酸化されるNPH3の全ての部位をアミノ酸置換し、恒常的疑似リン酸化タイプと恒常的脱リン酸化タイプに改変し、それらをnph3突然変異体に導入した。それらの形質転換体の胚軸光屈性を調べた結果、恒常的疑似リン酸化タイプの場合では、強い青色光によって誘導される光屈性の反応が顕著に弱まっており、rpt2変異体と同様な表現型を示した。このことから、強い光に応答するためにはNPH3の脱リン酸化が必須であることが明らかになった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
今年度は、青色光によるNPH3のリン酸化状態の生理学的意味を明らかにするために、改変型NPH3遺伝子を導入したシロイヌナズナの形質転換体を用いて、胚軸光屈性の反応を調べることができた。改変型のNPH3に蛍光タンパク質をつなげたYFP-NPH3のコンストラクトも作成しており、NPH3のリン酸化状態とNPH3の細胞内の挙動の解析につなげる準備も行っている。また、光の感度調節に働くRPT2とそのホモログであるNRLファミリーの突然変異体を用いて多重変異体を作製し、胚軸光屈性を調べる段階に来ている。一方、植物の光順応に係る新規因子の同定については、新規光屈性突然変異体を分離するために、EMS処理したシロイヌナズナ種子から候補となる突然変異体を選抜し、次世代シークエンサーなどを用いた解析によって、その原因遺伝子がフォスファターゼをコードする遺伝子（PP2C 遺伝子）であることを突き止めている。現在、それらの遺伝子とそのホモログ遺伝子についてタグラインを取り寄せ、それらの二重変異体の作成にも着手している。以上のことから、本研究はおおむね順調に進行していると考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
１）光屈性におけるNRLファミリーの働きについて。前年度の研究によって作製したNRLファミリーの多重変異体（rpt2 nrl18 二重変異体とrpt2 nrl31 二重変異体）について、胚軸の光屈性を詳細に解析する。目的の表現型が確認された場合、青色光に応答したNPH3のリン酸化状態の変化についてウエスタンブロッティングで解析する。また、YFP-NPH3を発現させたラインを交配によって作製し、青色光によるNPH3の一過的な細胞膜からの離脱反応を調べることで、特にNCH1の光屈性における働きを明らかにする。
２）青色光によるNPH3のリン酸化制御の生理学的意味について。改変型NPH3にYFP蛍光タンパクをつなげたコンストラクトを導入したシロイヌナズナ形質転換体を用いて、青色光に応答したNPH3の細胞内の局在変化を調べる。また、それらのコンストラクトをrpt2 突然変異体に導入し、青色光に応答したNPH3の局在変化におけるRPT2の働きを明らかにする。
３）NPH3を介した光屈性シグナル伝達に係る新規因子の同定について。新規光屈性関連遺伝子として同定したフォスファターゼ遺伝子（PP2C 遺伝子）について、取り寄せたタグラインおよびそのホモログの二重変異体を作製する。作製した二重変異体および単独変異体について、胚軸光屈性を中心に生理学的解析を詳細に行う。また、細胞内局在を調べるために蛍光タンパク質につなげたコンストラクトを作製し、それぞれの突然変異体に導入する。得られた形質転換体を用いて、PP2Cの細胞内局在および青色光による局在変化を調べることで、新規光屈性関連遺伝子の働きを明らかにする。
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