| 研究課題/領域番号 |
17K07465
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| 研究機関 | 宇都宮大学 |
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研究代表者 |
松田 勝 宇都宮大学, バイオサイエンス教育研究センター, 教授 (20414013)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | メダカ / 性決定 / 性分化 / 性転換 / 性ホルモン |
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| 研究実績の概要 |
動物の性別は、卵巣にも精巣にも分化可能な未分化生殖腺が卵巣に分化するか精巣に分化するか、によって決定される。遺伝的に性別の決定されている魚類において、性ホルモンなどの外的要因によって完全な性転換の起こることは1950年代にメダカで示された事実である。しかしながら、そのような性転換時にどのような遺伝子がどのように働くことによって、本来の生殖腺の分化の方向（遺伝的性別）と異なる方向へと分化が進むのかは未だよく分かっていない。そこで、本研究では、応募者の作出した遺伝子破壊メダカを駆使して、遺伝的雌から雄へ性転換する時の分子機構を明らかとすることを目的とした。
このような目的にメダカは最適な実験動物である。メダカの性別はXX-XYの雄ヘテロの遺伝様式で決定され、性決定遺伝子がY染色体上のdmyであることがわかっている。dmyは、孵化数日前のXY胚の生殖細胞を取り囲む体細胞特異的にそのmRNAの発現が始まる。また、変異体の解析から未分化生殖腺を精巣に分化させる際に重要な働きをしていることがわかっているdmrt1とgsdfは、共に性決定遺伝子の発現細胞と同じ細胞で発現する。
本研究では、(a) 近交系として樹立されており遺伝的背景が均一なHd-rR系統、(b) dmrt1コード領域の点突然変異を戻し交配により、近交系Hd-rRの遺伝的背景にいれたdmrt1-KO系統（この変異をホモにもつXY個体は全て雌に分化する）、(c) gsdfコード領域を欠損させることにより、この対立遺伝子をホモにもつXY個体の生殖腺がふ化後５日までは雌型となるgsdf-KO系統、の３系統を用い、通常飼育と、性転換誘導条件下での飼育時の遺伝子発現の変化を網羅的に探索する。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
低温インキュベータを飼育室に設置し、安定した温度条件で受精卵を保温することで、孵化までの日数のばらつきを抑えることができるようになった。採卵後，同一サンプルからDNAとRNAとを別々に抽出した。抽出したDNAからPCR法により遺伝子型判定を行いそれぞれの個体の遺伝子型を確認した上でRNA抽出を行った。しかし，RNAの質が十分ではなかったために，抽出方法を検討することとした。特にRNA安定化試薬に入れる時間，および組織のホモジナイズがRNAの収量および品質に重要であることがわかった。これらの点を改善してサンプルを収集していく計画である。
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| 今後の研究の推進方策 |
５-10個体分のRNAをまとめて次世代シークエンサーで解析することで，発現プロファイルを比較する。
また，飼育条件として以下の５つ、(1) 男性ホルモン（17α-メチルテストステロン）処理、(2) コルチゾール処理、(3) 通常水温・飼育水、(4) 通常水温・エタノール含有飼育水で，孵化まで保温した胚からDNAとRNAを同時に抽出し，DNAを鋳型に遺伝型を解析することで，同一遺伝子型の個体５個体分を混ぜてRNA抽出する計画である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
研究計画遅延のため残額が生じた。抽出したRNAのRNA-Seqの受託費用が主な使途である。
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