高圧凍結技法と相関アレイトモグラフィーで植物細胞内膜系の３次元超微形態を捉える

2017 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 17K07477
• 研究機関: 国立研究開発法人理化学研究所
• 研究代表者: 豊岡 公徳 国立研究開発法人理化学研究所, 環境資源科学研究センター, 上級研究員 (10360596)
• 研究期間 (年度): 2017-04-01 – 2020-03-31
• キーワード: 高圧凍結技法 / アレイトモグラフィー / 植物細胞 / ３次元超微形態 / 光電子相関顕微鏡 / 細胞内輸送 / 膜交通 / 電子顕微鏡

研究実績の概要

通常の化学固定で良好な光電子相関顕微鏡(CLEM)解析の結果を得ているERボディGFP及びペルオキシソームGFP発現株、エンドメンブレン系分子のSCAMP2-YFPやSYP41-YFP形質転換体シロイヌナズナの芽生え(発芽7－10日の根、葉)を用いて、高圧凍結固定・凍結置換を行った。アクリル系樹脂包埋のあとに、ダイヤモンドナイフを用いてウルトラミクロトームにより500nmまたは1000nmの準超薄切片を作製し、カバーガラスに貼付け、共焦点レーザー顕微鏡を用いて蛍光撮影を行った。いくつかのGFP退色防止剤等を含め、最も自家蛍光が少なく、蛍光色素の蛍光強度が強い処理条件を検討した。しかしながら、消失した蛍光はアルカリ処理や退色防止剤で復帰しなかった。そこで、低pHに強い赤色蛍光タンパク質RFPで標識したゴルジ体やエンドソームなどのエンドソーム系も用いて検討を進めるとともに、RFP結合SCAMP2形質転換体作製し、分泌に関与する小胞塊の可視化を進めている。
日立ハイテク社とともに、光顕で撮影した部位と同一箇所をFE-SEMで撮影し、正確かつ容易に画像が重ね合わせることができるCLEM解析システムMirrorCLEMの改良を進め、ソフトウェアの改良や新しい治具を追加し、利便性を向上させた。
切片が厚いほど蛍光強度は強くなるが、FE-SEM像は加速電圧にもよるが厚い切片ではZ軸方向に像が重なってぼやけた像として検出されるため相関が取りにくいことがある。そこで、100-200nmなど可能な限り薄い切片を作製し、高感度の最新の共焦点レーザー顕微鏡により蛍光を検出することで微弱な蛍光を検出でき、かつ自家蛍光を取り除くことができた。
これらの成果はアメリカ顕微鏡学会や日本顕微鏡学会などで発表を行った。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

RFPなど蛍光タンパク質を結合させた細胞内輸送系の形質転換体作製を行えるよう分子生物実験系を立ち上げた。年度の途中に高圧凍結装置が故障し、新しいものに買い換えるトラブルがあったが、概ね順調に進展している。

今後の研究の推進方策

新しい高圧凍結装置は今までより３倍凍結面積が大きいため、大きい試料を凍結固定することができる。これらの凍結技術の検討を行うとともに、準超薄切片の蛍光撮影とFE-SEM観察で相関が取りやすい方法を検討する。Z軸方向の相関を取るのが難しいため、共焦点レーザー顕微鏡で広域かつZ方向に撮影するとともに、FE-SEMでも連続切片を撮影するなど工夫する。光電子相関顕微鏡解析ソフトMirrorCLEMの改良をさらに進め、GUIの向上や位置合わせが容易にできるよう改良を進める。

研究成果

• [雑誌論文] Plastid translation is essential for lateral root stem cell patterning in Arabidopsis thaliana (2018)
  • 著者名/発表者名: Nakata Miyuki T.、Sato Mayuko、Wakazaki Mayumi、Sato Nozomi、Kojima Koji、Sekine Akihiko、Nakamura Shiori、Shikanai Toshiharu、Toyooka Kiminori、Tsukaya Hirokazu、Horiguchi Gorou
  • 雑誌名: Biology Open 巻: 7 ページ: 028175
  • DOI: 10.1242/bio.028175
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] A novel plasma membrane-anchored protein regulates xylem cell-wall deposition through microtubule-dependent lateral inhibition of Rho GTPase domains (2017)
  • 著者名/発表者名: Sugiyama Y, Wakazaki M, Toyooka K, Fukuda H, Oda Y
  • 雑誌名: Current Biology 巻: 27 ページ: 2522-2528
  • DOI: https://doi.org/10.1016/j.cub.2017.06.059
  • 査読あり
• [雑誌論文] Ectopic colonization of oral bacteria in the intestine drives TH1 cell induction and inflammation" Ectopic colonization of oral bacteria in the intestine drives TH1 cell induction and inflammationx (2017)
  • 著者名/発表者名: Atarashi K, Suda W, Luo C, Kawaguchi T, Motoo I, Narushima S, Kiguchi Y, Yasuma K, Watanabe E, Tanoue T, Thaiss CA, Sato M, Toyooka K, Said HS, Yamagami H, Rice SA, Gevers D, Johnson RC, Segre JA, Chen K, Kolls JK, Elinav E, Morita H, Xavier RJ, Hattori M, Honda K.
  • 雑誌名: Science 巻: 358 ページ: 359-365
  • DOI: 10.1126/science.aan4526
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Protonema of the moss Funaria hygrometrica can function as a lead (Pb) adsorbent (2017)
  • 著者名/発表者名: Itouga M, Hayatsu M, Sato M, Tsuboi Y, Kato Y, Toyooka K, Suzuki S, Nakatsuka S, Kawakami S, Kikuchi J, Sakakibara H
  • 雑誌名: PLOS ONE 巻: 12 ページ: e0189726
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0189726
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] The karrikin receptor KAI2 promotes drought resistance in Arabidopsis thaliana (2017)
  • 著者名/発表者名: Li W, Nguyen KH, Chu HD, Ha CV, Watanabe Y, Osakabe Y, Leyva-Gonzlez MA, Sato M, Toyooka K, Voges L, Tanaka M, Mostofa MG, Seki M, Seo M, Yamaguchi S, Nelson DC, Tian C, Herrera-Estrella L, Tran LP.
  • 雑誌名: PLOS Genetics 巻: 13 ページ: e1007076
  • DOI: 10.1371/journal.pgen.1007076
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] 植物と微生物の攻防を電子顕微鏡で捉えるには？ (2017)
  • 著者名/発表者名: 佐藤 繭子，成川-篠崎 苗子，豊岡 公徳
  • 雑誌名: 植物科学の最前線（BSJ-Review） 巻: 8 ページ: 29-35
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] 植物の免疫電子顕微鏡法 (2017)
  • 著者名/発表者名: 佐藤 繭子, 後藤 友美, 豊岡 公徳
  • 雑誌名: 顕微鏡 巻: 52 ページ: 98-103
  • 査読あり
• [学会発表] Development of rapid and accurate correlative light and electron microscopy for fluorescence-labeled organelles using FE-SEM (2018)
  • 著者名/発表者名: Kiminori Toyooka
  • 学会等名: 広島大学理学部主催国際シンポジウム
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] 光電子相関顕微鏡法の開発とその応用：蛍光タンパク質の局在をFE-SEMで捉える (2017)
  • 著者名/発表者名: 豊岡公徳
  • 学会等名: 第147回電子顕微鏡技術研究会
  • 招待講演
• [学会発表] 生物試料の光電子相関顕微鏡法：光顕で観察した同一切片をFE-SEMで捉える (2017)
  • 著者名/発表者名: 豊岡公徳, 成川苗子, 佐藤繭子, 前田躍, 羽根田茂, 星野吉延, 許斐麻美, 川俣茂
  • 学会等名: 日本顕微鏡学会第73回学術講演会
• [学会発表] シロイヌナズナ根端における ERボディ様構造体の超微形態解析 (2017)
  • 著者名/発表者名: 橋本恵, 成川苗子, 佐藤繭子, 岡本龍史, 豊岡公徳
  • 学会等名: 日本植物学会第81回大会
• [学会発表] Effective Detection of Fluorescence-labeled Plant Organelles in Resin Section using MirrorCLEM with FE-SEM (2017)
  • 著者名/発表者名: Toyooka K., Narikawa N., Sato M., Maeda Y., Haneda S., Hoshino Y., Konomi M.,Kawamata K.
  • 学会等名: M&M 2017 Microscopy & MicroAnalysis
  • 国際学会
• [学会発表] 光電子相関顕微鏡法（CLEM）の基礎と応用 (2017)
  • 著者名/発表者名: 豊岡公徳
  • 学会等名: 日本顕微鏡学会 SEM分科会主催SCANTECH2017
  • 招待講演
• [学会発表] 樹脂包埋組織切片中のGFP蛍光を捉える効果的な光電子相関顕微鏡法の検討 (2017)
  • 著者名/発表者名: 豊岡公徳, 成川苗子, 佐藤繭子, 前田躍, 羽根田茂, 許斐麻美, 川俣茂, 星野吉延
  • 学会等名: 日本顕微鏡学会第60回記念シンポジウム
• [備考] 鉛吸着材に使えるコケの新たな生物機能を発見
  • URL: http://www.riken.jp/pr/press/2018/20180117_1/
• [備考] 口腔常在菌の中には、 異所性に腸管に定着すると免疫を活性化するものがいる
  • URL: https://www.keio.ac.jp/ja/press-releases/files/2017/10/20/171020-1.pdf
• [備考] セルロース合成の”足場”増やす遺伝子を発見
  • URL: https://www.nig.ac.jp/nig/ja/2017/08/research-highlights_ja/20170811.html