| 研究課題/領域番号 |
17K07661
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| 研究機関 | 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 |
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研究代表者 |
中島 育子 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 果樹茶業研究部門, 上級研究員 (80355362)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | ブドウ / ゲノム編集 / 巨峰 |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、温暖化により果皮の着色不良が問題となっている四倍体ブドウ「巨峰」において、ゲノム編集技術を用いて着色能を増強させることにより、着色の安定化を試みるものである。転写活性のあるMYB転写因子の数は着色に影響しており、四倍体である「巨峰」には着色制御に関連するMYB転写因子が4個あるうち2個には活性がある。活性のない2個にはプロモーター中にレトロトランスポゾンが存在しており、発現が抑制されている。そこで、レトロトランスポゾンをゲノム編集技術により切り出すことによって活性を取り戻し、転写活性のあるMYB転写因子の数を増やすことによって着色を安定化するものである。そのために、「巨峰」のエンブリオジェニックカルスを誘導・増殖し、人工制限酵素遺伝子をアグロバクテリウムにより導入する。四倍体ブドウ「巨峰」でゲノム編集が可能かを検討するために、まずは植物のカロテノイド合成に関わる遺伝子で変異が入ると植物細胞が白化するPDS遺伝子を標的とし、次にレトロトランスポゾンを標的とする。
平成29年度は4℃で保存した「巨峰」の休眠枝をインキュベーター内で成育させて蕾を得た。蕾の中から未受精胚珠などを無菌的に取り出し、液体振盪培養を行うことでエンブリオジェニックカルスを得た。エンブリオジェニックカルスに、PDS遺伝子を標的としたベクターを構築し、アグロバクテリウム法で、予備的に感染させた。今後エンブリオジェニックカルスが増え次第、本格的にアグロバクテリウムを感染させる予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
4℃で保存していた「巨峰」の休眠枝を2芽ずつで切り、ロックウールに挿して、22℃16時間日長8時間暗黒下で発芽（発蕾）を促した。蕾が出てきたものは、成育が進んで蕾同士が離れ始めた頃に有効塩素1％の次亜塩素酸ナトリウム水溶液で滅菌し、滅菌水で2回洗った。実体顕微鏡下で蕾の中から未受精胚珠や花糸を取り出し、1マイクロモル 2,4-D、1マイクロモル TDZと30g/Lシュークロースを含んだ1/2MS液体培地に置床した。26℃暗黒条件下において60rpmで振盪培養を行った。得られたエンブリオジェニックカルスは1マイクロモル 2,4-D、50g/Lマルトースおよび3％寒天を含んだ1/2MS培地で継代、増殖を行っている。このように休眠枝を用いることで、圃場の材料を用いる場合のように1年に一度きりではなく、エンブリオジェニックカルスを誘導することが可能となった。PDS遺伝子の配列の中から、CRISPR/Cas9システムで切断でき、かつ変異が導入されると制限酵素で切断できなくなる配列を選び、guideの配列とした。このようにすることで、変異が導入された場合にCAPS解析が可能となる。遺伝子組換え細胞（再分化植物）の選抜にはカナマイシンが有効であるため、カナマイシン耐性遺伝子を用いた。Cas9とguide RNA（およびカナマイシン耐性遺伝子）一体型のベクターを作成し、アグロバクテリウムLBA4404へ導入した。エンブリオジェニックカルスにPDS遺伝子を標的としたCRISPR/Cas9ベクターを持つアグロバクテリウムを予備的に感染させた。今後エンブリオジェニックカルスが増え次第、本格的にアグロバクテリウムを感染させる予定である。
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| 今後の研究の推進方策 |
エンブリオジェニックカルスが増殖し次第、本格的にPDS遺伝子を標的としたベクターを持つアグロバクテリウムを感染させ、選抜培養を行う。選抜途中のカルスあるいは不定胚などからDNAを抽出してCAPS解析を行うことにより、四倍体ブドウ「巨峰」でゲノム編集が可能であることを確認して、技術確立を行う。四倍体ブドウ「巨峰」で、転写活性の無い2つのMYB転写因子をゲノム編集により、着色活性を付与するために、レトロトランスポゾンGret1を切り出す必要がある。そのために、Gret1の切り出し確認の際に必要となる果皮の着色に関係するMYB転写因子近傍の詳細な塩基配列情報を得る。MYB近傍の塩基配列を元にGret1切り出しのためのCas9とguide RNA一体型ベクターを構築し、アグロバクテリウム（LBA4404）へ導入する。増殖させたエンブリオジェニックカルスへGret1を標的としたCRISPR/Cas9ベクターを持つアグロバクテリウムを感染させ、選抜培養を行う。カルスや不定胚などが得られればDNAを抽出し、Gret1が抜けるとバンドが出るMYB判別プライマーを用いてPCRを行い、Gret1の欠失状況を検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
エンブリオジェニックカルス誘導のため、これまでの様に圃場の樹を用いると一年に1度しか蕾が得られないが、4℃保存した休眠枝から得た蕾をエンブリオジェニックカルスの誘導に使えるようになった。そのため実験を集約的に行わないですみ、研究費を節約することが出来た。次年度使用額はGret1の切り出し確認の際に必要となる果皮の着色に関係するMYB転写因子近傍の詳細な塩基配列情報を得るための試薬等の経費として用いる計画である。
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