| 研究課題/領域番号 |
17K07661
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| 研究機関 | 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 |
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研究代表者 |
中島 育子 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 果樹茶業研究部門, 上級研究員 (80355362)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | ブドウ / ゲノム編集 / 巨峰 |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、温暖化により果皮の着色不良が問題となっている四倍体ブドウ「巨峰」において、ゲノム編集技術を用いて着色能を増強させることにより、着色の安定化を試みるものである。転写活性のあるMYB転写因子の数は着色に影響しており、四倍体である「巨峰」には着色制御に関連するMYB転写因子が4個あるうち2個には活性がある。活性のない2個にはプロモーター中にレトロトランスポゾンが存在しており、発現が抑制されている。そこで、レトロトランスポゾンをゲノム編集技術により切り出すことによって活性を取り戻し、転写活性のあるMYB転写因子の数を増やすことによって着色を安定化するものである。一般的にブドウの形質転換はエンブリオジェニックカルスへアグロバクテリウムを感染させることにより成功している。そのため、「巨峰」のエンブリオジェニックカルスを誘導・増殖した。四倍体ブドウ「巨峰」でゲノム編集が可能かを検討するために、まずは植物のカロテノイド合成に関わる遺伝子で変異が入ると植物細胞が白化するPDS遺伝子を標的とし、次に果皮の着色に関連するレトロトランスポゾン（Gret1）を標的とする。これまでにブドウ二倍体品種「ネオマスカット」ではPDS遺伝子への変異導入個体が得られ、「シャインマスカット」ではGret1欠失の認められるカルスが複数得られた。
平成30年度は、「巨峰」のGret1の5’および3’LTR領域をシークエンスし、配列の確認を行う。また、誘導・増殖した「巨峰」のエンブリオジェニックカルスにPDS遺伝子を標的、あるいはGret1欠失を目標としたベクターを持つアグロバクテリウムを感染させ、形質転換候補カルスや不定胚を得る。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
「シャインマスカット」でGret1の欠失を狙ってGret1の5’および3’LTR領域にCas9のguideを5カ所設計したところ、形質転換カルスにおいて#4のguideを用いた場合に最も切れることが分かった。「巨峰」のGret1の5’および3’LTR領域についてシークエンスして確認したところ、guide#4の配列が同じであること、guide#4の配列近辺に5’および3’LTR領域の間で4カ所のSNPがあることが明らかになった。「巨峰」についてもguide#4の配列をターゲットとして用いることが出来ると考えられる。
PDS遺伝子への変異導入、Gret1欠失を目的としたベクターを持つアグロバクテリウムを「巨峰」のエンブリオジェニックカルスへ感染させたが、形質転換候補カルスや不定胚が得られなかった。要因として、「巨峰」の形質転換効率が欧州系のブドウ品種と比べて低いことや、アグロバクテリウムのオーバーグロースが全く認められなかったことから、感染操作の準備で行う遠心が想定よりも強く、アグロバクテリウムが操作過程で死んでしまった可能性が考えられる。形質転換候補カルスや不定胚が得られなかったため、GFPプラスミドをエンブリオジェニックカルスへパーティクルガンを用いて打ち込んでみたところ、一過的なGFP蛍光スポットが多数認められた。
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| 今後の研究の推進方策 |
感染操作の際、遠心の強度を下げることで、PDS遺伝子を標的としたベクターを持つアグロバクテリウムの「巨峰」エンブリオジェニックカルスへの感染を再度行う。また、Gret1欠失を目的としたguideで設計したCRISPR/Cas9一体型ベクターを持つアグロバクテリウムについてもエンブリオジェニックカルスへ再度感染させる。「巨峰」ではアグロバクテリウムの感染効率が低いことも考えられるため、パーティクルガンを用いたブドウエンブリオジェニックカルスへのGFPプラスミド導入の最適化を行う。最適化した条件を用いてゲノム編集酵素の直接導入についても試みる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
形質転換候補カルスや不定胚が得られなかったため、変異検出に関連する試薬などがあまりかからなかった。今年度再度アグロバクテリウムの感染を行い、変異検出に役立てる計画である。
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