| 研究課題/領域番号 |
17K07661
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| 研究機関 | 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 |
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研究代表者 |
中島 育子 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 果樹茶業研究部門, 上級研究員 (80355362)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | ブドウ / ゲノム編集 |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、温暖化により果皮の着色不良が問題となっている四倍体ブドウ「巨峰」で、ゲノム編集技術を用いて着色能を増強させることにより、着色の安定化を試みる。転写活性のあるMYB転写因子の数は着色に影響しており、四倍体である「巨峰」には着色制御に関連するMYB転写因子が4個あるうち2個は活性があり、活性のない2個にはプロモーター中にレトロトランスポゾン（Gret1）が存在することで発現が抑制されている。そこで、Gret1をゲノム編集技術で切り出すことで活性を取り戻し、転写活性のあるMYB転写因子の数を増やすことで着色を安定化させる。CRISPR/Cas9システムを導入するため「巨峰」のエンブリオジェニックカルス（EC)を誘導・増殖した。これまでにブドウ二倍体品種「ネオマスカット」では植物のカロテノイド合成に関わる遺伝子で変異が入ると植物細胞が白化するPDS遺伝子への変異導入に成功しており、「シャインマスカット」ではGret1の欠失を狙ってGret1の５’および3’LTR領域に設計したCas9のguideのうち、#4を用いた場合にGret1の欠失の認められる再分化個体が複数認められた。「巨峰」においてもguideの#4の部分のシークエンスを確認したところ、「シャインマスカット」と配列が同じであったため、すでに欠失させられることを確認できた同じguideを用いることが出来ると考えられる。令和２年度は、「巨峰」のECにGret1欠失を目標としたCRISPR/Cas9一体型ベクターを持つアグロバクテリウム、あるいはコントロールとしてGFPプラスミドを持つアグロバクテリウムを感染させ、形質転換候補カルスや不定胚を得ることを目標とした。その結果、GFP発現の認められる不定胚、およびGret1の欠失を目標とする形質転換候補不定胚および植物体が得られた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
これまで、誘導した「巨峰」のECにPDS遺伝子への変異導入、Gret1欠失を目的としたCRISPR/Cas9一体型ベクターを持つアグロバクテリウムを感染させたが、感染操作の際、遠心の強度が強すぎたことが一因と考えられ、形質転換候補カルスや不定胚が得られていなかった。その後、遠心強度を抑えるとともに、状態のよいECをアグロバクテリウムの感染に用いることで、GFP遺伝子導入を試みた場合では全体的にGFP蛍光が認められる不定胚を得ることができた。同じ方法を用いてGret1欠失を目標とした感染実験でも不定胚を複数得ることができた。GFP導入で得られた不定胚がGFP蛍光を示したことから、Gret1欠失を目標として得られた不定胚は形質転換体である可能性が高いと考えられる。これら不定胚からの植物体分化を試みたところ、少数であるが再分化植物体が得られた。
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| 今後の研究の推進方策 |
Gret1欠失を目標とした形質転換候補不定胚をさらに獲得するとともに、植物体への分化を促す。形質転換候補不定胚の一部について、PCRにより形質転換を確認する。分化した植物体についてはさらに生育させるとともに、一部をサンプリングしてPCRにより形質転換を確認するとともにGret１欠失についても確認する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
新型コロナ感染拡大による緊急事態宣言発令により勤務時間の削減が行われ、感染実験が行えなかった。また、ECの状態を整えるのに時間を要したため、変異検出等に関連する試薬費などがあまりかからなかった。今年度は、形質転換候補不定胚をさらに獲得するとともに、得られた形質転換候補不定胚および再分化植物体が形質転換体であるかの確認を行う。また、Gret1欠失についても確認を行う。予算はこれらの実験および変異検出に役立てる計画である。
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