| 研究課題/領域番号 |
17K07665
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| 研究機関 | 信州大学 |
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研究代表者 |
加藤 新平 信州大学, 学術研究院農学系, 准教授 (10533614)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 病害抵抗性 / サリチル酸 / 生合成 / ペルオキシソーム / β酸化 |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、タバコにおけるサリチル酸 (SA) 合成経路とその制御機構を明らかにするため、以下の2つの小課題を実施した。
＜1. ペルオキシソームのβ酸化系を介したSA合成経路の構成因子＞
小課題1の目的は、これまでの我々の研究により同定されたSA合成経路の候補遺伝子 (CL、CHD、KAT、2OGD、HCT、HSR201、HSR203J等) が実際にSAの合成に関与するかどうかを明らかにすることである。2019年度は、前年度に引き続きVIGS (virus-induced gene silencing) によるベンサミアナタバコの候補遺伝子ホモログの発現抑制がSAの合成に及ぼす影響を調べた。その結果、CHDおよびKATの抑制により病原体ストレスに応答したSAの蓄積が減少することが明らかになった。CHDとKATおよび前年度に既にSA合成への関与が明らかになっているCLは、ペルオキシソームにおけるβ酸化に関与すると考えられており、「SAがペルオキシソームのβ酸化を介して合成される」という我々の仮説が正しいことが強く示唆された。
＜2. CBP60型転写因子・NtCBP60によるSA合成の制御機構＞
小課題2の目的は、NtCBP60がSA合成を活性化する機構を明らかにすることである。これまでに、1) NtCBP60がHSR203Jのプロモーターを活性化すること、2) HSR203Jプロモーター中の25塩基がNtCBP60による活性化に必要であることを明らかにしている。2019年度は、この25塩基周辺の領域にNtCBP60が直接結合するか調べるため、精製したNtCBP60の組換えタンパク質とビオチン標識したオリゴDNAを用いてゲルシフト解析を行った。その結果、様々な条件で実験を行ったが、結合を示すバンドのシフトは検出されなかった。そのため、現在はクロマチン免疫沈降法を用いて、NtCBP60gがHSR203Jプロモーターに結合するか調べている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
小課題1では、VIGSを用いた発現抑制により、CL、CHDおよびKATがSA合成に関与することを明らかにすることができた。これらのタンパク質はペルオキシソームにおけるβ酸化に関与すると考えられており、実際にペルオキシソームに局在することがこれまでの我々の研究より明らかになっている。そのため、タバコやベンサミアナタバコにおけるSA合成の少なくとも一部が、ペルオキシソームのβ酸化を介して行われることが更に強く示唆された。現在、他の候補遺伝子のベンサミアナホモログについても、VIGSによる発現抑制がSA合成に影響を及ぼすかどうか調べている。
小課題2では、HSR203Jプロモーター上に存在するNtCBP60による活性化に必要な領域に、NtCBP60が直接結合するかどうかゲルシフト解析を用いて検討したが、様々な条件で実験を行っても結合は検出できなかった。そのため、現在はクロマチン免疫沈降法を用いてNtCBP60がHSR203Jプロモーターに結合するかどうか調べている。
以上のことを総合し、本研究はおおむね順調に進展していると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
タバコおよびベンサミアナタバコにおけるSA合成経路とその制御機構を明らかにするため、2020年度は以下のように研究を推進する。
＜1. ペルオキシソームのβ酸化系を介したSA合成経路の構成因子＞
我々が同定したSA合成経路の候補遺伝子 (CL、CHD、KAT、2OGD、HCT、HSR201、HSR203J等) が実際にSAの合成に関与するかどうかを明らかにする。2020年度は、ベンサミアナタバコの候補遺伝子ホモログの発現抑制により病原体ストレスにより誘導されるSA合成が減少するかどうかを引き続き調べる。既にSA合成への関与が明らかになっているCL、CHDおよびKATについては、ペルオキシソームにおけるβ酸化に関与すると考えられているため、それらの組換えタンパク質を調製し、1) 実際にβ酸化反応に関わる活性を持つかどうか、2) どのような化合物を基質とするか明らかにする。
＜2. CBP60型転写因子・NtCBP60によるSA合成の制御機構＞
クロマチン免疫沈降法を用いてNtCBP60がHSR203Jプロモーターに結合するかどうか明らかにする。これまでに、1) NtCBP60のC末端側に3xFLAGタグを付加したNtCBP60-3xFLAGがタグ無しのNtCBP60と同様に働くこと、2) NtCBP60-3xFLAGを、抗FLAG抗体を用いた免疫沈降により回収できることを明らかにしている。NtCBP60-3xFLAGとHSR203Jプロモーターの結合を検出できた場合は、他の候補遺伝子のプロモーターについても同様に調べる。
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