研究課題
植物毒素など多様な生理活性物質生産は、植物病原糸状菌の発病ストラテジーにおいて、極めて重要な位置を占める。そのため、一般的に病原菌は、腐生菌(非病原菌)と比較して多種多様な生理活性・化学構造を有する二次代謝産物（Secondary metabolite、SM）を生合成する。さらにSMは、宿主植物を加害するためだけではなく、宿主不在期間は、土壌中などにおける他者との競合と生存のため活用されている。また、エンドファイトでは、宿主との共生関係確立にSMが重要な役割を果たす。すなわち、SMは、腐生菌（非病原菌）、共生菌および病原菌を分かつ要因のひとつとなり、さらに病原菌においてはエフェクター分子として病原性の分化に大きく寄与してきたと考えられる。本計画では、糸状菌が生産する多様なSMに焦点を当てるが、特に毒素などのSM生合成を菌の生存・発病ストラテジーの一つとしてとらえ、生合成の分子機構と多様性、また生合成系の進化について検討する。研究においては、世界的にもメジャーなネクロトロフ（necrotroph）植物病原菌であるAlternaria alternataを主として使用する。Alternaria属菌は、病原菌のみならず、腐生菌およびエンドファイト（共生菌）も含んでおり、菌の多様なライフスタイルを決定する分子機構解明の優れたモデル糸状菌である。本計画では、以下の3点を通して、SM生合成が介在するネクロトロフ菌の生存・発病戦略、多様性形成および進化の分子機構を明らかにする。1. Alternaria属の病原菌・腐生菌および共生菌間における比較・系統ゲノミクス、2. SM生合成遺伝子クラスターの同定とカタログ化、3. SM生合成遺伝子群の網羅的機能解析、代謝産物の同定および進化・多様性形成過程の推定
2: おおむね順調に進展している
本年度は、主に、Alternaria属の病原菌および腐生菌間における比較ゲノミクスとSM生合成遺伝子クラスターの同定・比較について検討した。これまでに、トマト茎枯病菌（A. alternata tomato pathotype）1菌株においては、ほぼ完全なゲノムデータを得ることに成功し、リファレンスデータとして活用した。さらに、従来、解析対象となる機会の少ない腐生性（非病原性）系統についても十分な解析を行う点が、本計画のポイントのひとつである。腐生性A. alternata ターゲット株の一つは、申請者らがペルー共和国のトマト野生種より分離した系統である。比較病原菌であるトマト茎枯病菌はAAL毒素生産菌であり、毒素生合成遺伝子（ALT）クラスターは本菌が保有する1 MbのCD染色体に座乗している。本染色体の解析から、宿主特異的毒素に依存する植物病原菌における病原性の進化と多様性形成過程に、CD染色体の水平移動が関与しているとの作業仮説（染色体水平移動説）を提唱している。本小型染色体はA. alternata病原性系統に特徴的であり、従来、腐生性系統からは見出されず、その起源、由来は不明であったが、スクリーニングの結果、ペルー産株で構造類似の小型染色体保有腐生性系統を見出した。本菌はプロト病原性染色体を保有する、現在のトマト菌のプロト病原菌株である可能性が高い。本菌株におけるゲノム解析の結果、病原菌株と同様に複数のSMクラスターを保有しているが、ALTクラスターを欠失していることが明らかとなった。以上の結果から、トマト菌進化過程において、腐生菌が保有するプロト病原性染色体上に、病原性を支配するSMクラスターが形成される過程が重要であり、その形成過程に、クラスター単位の遺伝子水平移動が関与する可能性が示唆された。以上の結果から、研究計画は順調に進展していると判断された。
比較対象菌株において、SM生合成遺伝子クラスターの同定とカタログ化をさらに進めるとともに、SM生合成遺伝子群の網羅的機能解析、代謝産物の同定を通して、進化・多様性形成過程の推定を行う。対象とする病銀菌、腐生菌および共生菌菌株の保有する各種遺伝子クラスターにおいて、より多数のデータをカタログ化し、比較することにより、オーファンクラスター（生合生産物が未同定のクラスター）を含む、腐生菌・病原菌・共生菌に特徴的なクラスターをピックアップする。その後、個々のSMクラスターをターゲットにした機能解析に基づく、菌の生存・発病戦略を決定する実行因子同定のステップに移行する。その具体的手順は以下である。1. ターゲットクラスターのノックアウト（KO、遺伝子破壊）・異種発現：まず、クラスターの中心となるPKS、あるいはNRPS遺伝子のKOを遂行し、各クラスターの特異的欠失系統シリーズの作成を完了する。また、ターゲットクラスターの人為的な移入と発現を試みる。2. SM生合成遺伝子クラスター欠失・移入系統の腐生・寄生・共生生活能力の検定：クラスター欠失・移入系統の各種宿主植物に対する病原力、また定着能を接種実験により検定する。3. クラスター欠失・移入系統における代謝産物の化学的同定と進化・多様性形成過程の推定：機能が推定可能なクラスターに加え、機能未知クラスターに関して、クラスター構造からの産物予測や実際のLC-MS解析などを通して、SMの同定を目指す。これにより、SM遺伝子クラスターから最終産物までの対応が明確となる。以上より、菌の生存・発病戦略における実行因子を明らかにするとともに、腐生菌（非病原菌）、共生菌および病原菌を分かつ要因となるSM／クラスターを同定する。さらに、比較・系統ゲノミクスにより、ネクロトロフ菌のライフスタイルの進化と多様性形成の仕組みを推定する。
本年度は、研究計画遂行のためプロジェクト研究員等雇用として人件費を計上していたが、研究代表者および分担研究者と、それぞれ研究グループの大学院生の連携により研究計画を予想以上にスムーズに進行させることが可能となり、雇用の必要性が生じなかった。そのため今年度については人件費使用を抑え、研究計画から人件費等が必要になると予測される次年度に移すと判断した。さらに、本年度はゲノムデータ解析などPCとデータベースを活用した計画を重点的に進めたため、試薬等消耗品費を抑制することが可能となった。次年度の計画では、研究試薬等の物品を必要とする実験計画が中心となるため、次年度の物品費の一部を繰り越すこととした。これらの変更により、今後の研究計画に必要な予算が確保され、計画を順調に進めることが可能となると考えられる。
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Organic letters
巻: 19 ページ: 6696-6699
10.1021/acs.orglett.7b03418
