研究課題
植物病原菌が生産する植物毒素などの各種生理活性物質は、菌の発病ストラテジーにおいて極めて重要な位置を占める。そのため、一般的に病原菌は、腐生菌(非病原菌)と比較して多種多様な生理活性・化学構造を有する二次代謝産物（secondary metabolite、SM）を生合成する。さらにSMは、宿主植物を加害するためだけではなく、宿主不在期間は、土壌中などにおける他者との競合と生存のため活用されている。また、エンドファイトでは、宿主との共生関係確立にSMが重要な役割を果たす。すなわち、SMは、腐生菌（非病原菌）、共生菌および病原菌を分かつ要因のひとつとなり、さらに病原菌においてはエフェクター分子として病原性の分化に大きく寄与してきたと考えられる。本研究においては、世界的にもメジャーなネクロトロフ（necrotroph）植物病原菌であるAlternaria属菌を主として使用した。本菌は、病原菌のみならず、腐生菌およびエンドファイト（共生菌）も含んでおり、菌の多様なライフスタイルを決定する分子機構解明の優れたモデル糸状菌である。さらに、比較検討のため、他のネクロトロフ病原菌（毒素生産菌）として、Corynespora属およびCochliobolus属病原菌を使用した。また、典型的なエンドファイト菌として、Epichloe属エンドファイトも対象に加えた。これらライフスタイルの異なる各種菌を用いた比較・系統ゲノミクス、遺伝子機能解析等の手法により、ネクロトロフ病原菌、腐生菌および共生菌の生存・発病戦略および多様性形成と進化の過程に、SM生合成遺伝子クラスターが重要な役割を果たし、さらに、遺伝子クラスター・病原性染色体の水平移動が介在する可能性を明らかにした。
2: おおむね順調に進展している
本計画では、糸状菌が生産する多様なSMに焦点を当てるが、特に毒素などのSM生合成を菌の生存・発病ストラテジーの一つとしてとらえ、生合成の分子機構と多様性、また生合成系の進化について検討した。本年度は、Alternaria属病原菌・腐生菌に加え、Corynespora属およびCochliobolus属病原菌、さらに、共生菌であるEpichloe属エンドファイトを用いて検討を進めた。ゲノムドラフト解析の結果、Corynespora cassiicolaトマト菌およびキュウリ菌は、Cochliobolus heterostrophus race Tが生産するT-toxinの生合成遺伝子PKS1を含むT-toxin生合成遺伝子クラスターホモログを保有することを明らかにした。さらにCcPKS10破壊株は，野生株と比較して病原力の低下が認められた。本クラスターは、遺伝子水平移動により異なる病原菌群に分布し、菌の病原力に関与している可能性を示唆した。一方、Epichloe属菌は、イネ科植物に共生するエンドファイトである。国内各地から採集したElymus属植物から分離したE. bromicolaは、SMである家畜毒性化合物および昆虫毒性化合物生合成のための遺伝子クラスターを保有していることを明らかにした。これまでの研究成果として、Alternaria属病原菌の病原性の進化と分化の過程に、SM生合成遺伝子クラスターおよびそれらが座乗する病原性染色体の水平移動が関与することを解明している。今回の結果と合わせ、ネクロトロフ病原菌、腐生菌および共生菌の生存・発病戦略および多様性形成と進化の過程に、SM生合成遺伝子クラスターの形成とそれらの菌株間における水平移動が重要な役割を果たしている可能性が明らかとなった。
対象菌株において、SM生合成遺伝子クラスターの同定とカタログ化をさらに進めるとともに、SM生合成遺伝子群の網羅的機能解析、代謝産物の同定を通して、進化・多様性形成過程の推定を行う。対象とする病原菌、腐生菌および共生菌の保有する各種遺伝子クラスターにおいて、より多数のデータをカタログ化し、比較することにより、オーファンクラスター（生合生産物が未同定のクラスター）を含む、腐生菌・病原菌・共生菌に特徴的なクラスターをピックアップする。その後、個々のSMクラスターをターゲットにした機能解析に基づく、菌の生存・発病戦略を決定する実行因子同定のステップに移行する。その具体的手順は以下である。1. ターゲットクラスターのノックアウト（KO、遺伝子破壊）・異種発現：まず、クラスターの中心となるPKS、あるいはNRPS遺伝子のKOを遂行し、各クラスターの特異的欠失系統シリーズの作成を完了する。また、ターゲットクラスターの人為的な移入と発現を試みる。2. SM生合成遺伝子クラスター欠失・移入系統の腐生・寄生・共生生活能力の検定：クラスター欠失・移入系統の各種宿主植物に対する病原力、また定着能を接種実験により検定する。3. クラスター欠失・移入系統における代謝産物の化学的同定と進化・多様性形成過程の推定：機能が推定可能なクラスターに加え、オーファンクラスターに関して、クラスター構造からの産物予測や実際のLC-MS解析などを通して、SMの同定を目指す。これにより、SM遺伝子クラスターから最終産物までの対応が明確となる。以上より、菌の生存・発病戦略における実行因子を明らかにするとともに、腐生菌（非病原菌）、共生菌および病原菌を分かつ要因となるSM／クラスターを同定する。さらに、比較・系統ゲノミクスにより、ネクロトロフ菌のライフスタイルの進化と多様性形成の仕組みを推定する。
本年度は、研究計画遂行のため技術補佐員雇用として人件費を計上していたが、研究代表者および分担研究者と、それぞれ研究グループの大学院生の連携により研究計画を予想以上にスムーズに進行させることが可能となり、雇用の必要性が生じなかった。さらに、本年度はゲノムデータ解析などPCとデータベースを活用した計画を重点的に進めたため、試薬等消耗品費を抑制することが可能となった。また、研究成果を取り纏めて報文作製したが、共同研究者および査読者より、提示したデータと考察に関して、データの精度を高めるための追加（再現）実験および新たな実験の指示があった。その内容を詳細に検討した結果、目的をより精緻に達成し、インパクトのある成果公表を行うためには必要であるとの認識に至った。以上の理由から、次年度に追加研究を遂行する必要が生じたため、計画を延長し次年度使用額が生じた。
すべて 2020 2019 その他
すべて 国際共同研究 (2件) 雑誌論文 (3件) (うち国際共著 1件、 査読あり 3件) 学会発表 (4件) (うち国際学会 1件、 招待講演 1件)
The Plant Journal
巻: 101 ページ: 1103-1117
10.1111/tpj.14577
Journal of General Plant Pathology
巻: 85 ページ: 471-474
https://doi.org/10.1007/s10327-019-00877-3
日本植物病理学会報
巻: 85 ページ: 175-178
https://doi.org/10.3186/jjphytopath.85.175
