| 研究課題/領域番号 |
17K07670
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| 研究機関 | 酪農学園大学 |
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研究代表者 |
薦田 優香 酪農学園大学, 農食環境学群, 准教授 (90716482)
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| 研究分担者 |
中原 健二 北海道大学, 農学研究院, 講師 (90315606)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | ポティウイルス / 劣性抵抗性 / プロトプラスト |
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| 研究実績の概要 |
昨年度に引き続き、クローバ葉脈黄化ウイルスの複製とエンドウの劣性抵抗性遺伝子の関係について、詳細な解析を行った。
ルシフェラーゼ遺伝子を挿入したクローバ葉脈黄化ウイルスの野生型cDNAクローンおよび複製能欠損変異cDNAクローンを、エンドウ葉肉プロトプラストに感染させ、ルシフェラーゼ活性を指標にウイルス複製について解析した。その結果、変異型ウイルスにおいても高いルシフェラーゼ活性が得られたことから、実験系に不備があることが判明した。原因として、植物由来のRNAポリメラーゼIIによる転写活性能が高く、変異型ウイルスcDNAクローンが多量に転写されたため、高いルシフェラーゼ活性が検出されてしまった可能性が考えられた。そこで、転写阻害剤（アクチノマイシンD）を用いることとし、アクチノマイシンDの適した濃度および適した添加タイミングについての検討を行った。その結果、30 μg/mlの濃度で、cDNA導入後12時間にアクチノマイシンDをプロトプラストに添加することで、RNAポリメラーゼIIによる転写を阻害した上で、ウイルス複製活性を評価できることが示された。この方法を用いて、再度ウイルス複製がcyv1劣性抵抗性の影響を受けるかどうかについて解析を行った。その結果、cyv1存在・非存在下で、一細胞レベルでのウイルス蓄積量に大きな差は見られなかったことから、cyv1劣性抵抗性がウイルス複製を阻害することはないということが示唆された。
ダイズ液体培養細胞を用いたプロトプラストトランスフェクション実験系についての条件検討を行った。プロトプラスト化、トランスフェクション効率が非常に悪いため、効率を上げるための条件を検討中である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
2018年9月に起こった北海道胆振東部地震に伴う2日間の停電の影響により、液体培養細胞のほとんどが死滅し、培養細胞ラインの立ち上げ直しや取り寄せの必要性が発生したため。
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| 今後の研究の推進方策 |
引き続き、ダイズ培養細胞のプロトプラスト化、トランスフェクション実験系の確立を目指す。エンドウの培養細胞化も試みる。クローバ葉脈黄化ウイルスの試験管内での翻訳実験を試みる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
エンドウのプロトプラストを用いた、クローバ葉脈黄化ウイルスの一細胞レベルでの複製解析は進んでいる一方、2018年9月の停電の影響もあり、培養細胞を用いた実験については遅れが生じているため、次年度使用額が生じた。今後、培養細胞実験や試験管内実験の構築を目指した研究等に使用する計画である。
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