低温ストレス応答に関与する機能性ペプチドの同定と機能解析

2018 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 17K07690
• 研究機関: 国立研究開発法人理化学研究所
• 研究代表者: 中南 健太郎 国立研究開発法人理化学研究所, 環境資源科学研究センター, 研究員 (40513403)
• 研究期間 (年度): 2017-04-01 – 2020-03-31
• キーワード: 環境ストレス応答・耐性 / 低温ストレス応答・耐性 / 機能性ペプチド / シロイヌナズナ

研究実績の概要

環境ストレスの一つである低温ストレスに対する植物の応答・適応メカニズムの理解は，農作物の生育範囲拡大や生長促進・収量増につながる重要な研究である．植物の低温ストレス応答の研究は盛んに行われているが，近年注目されている研究分野であるペプチドホルモン・機能性ペプチドに関する報告は未だない．本研究は，低温ストレス耐性及び，越冬後の生長再開に関与する新規機能性ペプチドを同定することを目的とする．さらに，同定したペプチドを人工合成し，添加試験によりペプチドの機能解析を行うものである．本研究は，機能性ペプチドの低温ストレス応答時の機能を解析するものであり，植物の低温ストレス応答だけでなく，生長や発達に関する新規機能性ペプチド・ペプチドホルモンの発見につながる研究である．
これまでの研究で，カスタムマイクロアレイを用いた低温馴化または脱馴化で誘導性されるペプチドをコードする遺伝子の発現解析により，低温ストレス応答に関与する28個の新規な短い遺伝子の同定に成功した．現在，これら候補のうち発現誘導の高いものから順に，そのコードすると予想されるペプチドを人工合成し添加試験による植物の耐凍性の変化を調べている．これまでのペプチド添加試験において 1つのペプチドが，弱い活性ではあるが，低温耐性を高めることを見出した．現在，他の候補ペプチドの低温耐性に与える影響を試験すると共に，候補ペプチドさらなる機能解析のために過剰発現体・欠損変異体の作出を行なっている．

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

低温ストレス耐性及び，越冬後の生長再開に関与する新規機能性ペプチドを同定するために，マイクロアレイによるペプチドをコードする遺伝子（sORF）の発現解析を行った．その結果， 28 の新規sORFがNAと比較して，CA1d, CA7d, DA6h, DA24hのいずれかの処理で4倍以上に発現が上昇すること明らかとなった．このうち18個はCA1dで，13個はCA7dで，3個はDA6h, 24hでそれぞれ発現が高くなっており（CA1d, CA7dの間で重複する遺伝子があった），CAで発現が高くなった遺伝子は低温ストレス耐性に，DAで発現が高くなった遺伝子は越冬後の生長再開に関与するものと考えられた．
そこで，これら候補の中で発現誘導の高いものから順に，コードするペプチドを人工合成し，添加試験により植物の耐凍性を観察した．人工合成ペプチドは最大30アミノ酸として，全長がそれ以上の長さのものは各フラグメントがオーバーラップするようにして複数のペプチドを合成した．これまでに15ペプチドについて，耐凍性に関する影響を調べたところ， そのうちの1つのペプチドの添加により，弱い活性ではあるが，低温耐性を高める候補を見出した．現在さらに詳細な機能解析を進めている．

今後の研究の推進方策

最近の我々の機能性ペプチドの研究において，過剰発現体を用いたスクリーニングで見出されたsORFのうちの半数が，そのペプチドを人工合成し添加した場合に活性を示し（ストレス耐性を示す），半数は示さない結果となったことと，見出された候補がそれほど多くなかったことから，本年度は人工合成ペプチドの添加試験による機能解析を中心に行ってきた．その結果，スクリーニングにより１つのペプチド候補を見出した．今後は，この候補ペプチドの低温における発現パターンの解析や，欠損変異体を用いた機能解析を行う予定である．
またこれと並行して，その他の低温誘導性または脱馴化誘導性のsORFの過剰発現体・欠損変異体を作出してきたが，今後はこれらを用いたスクリーニングも行う予定である．過剰発現体・欠損変異体を用いたスクリーニングでは当初の予定通り，CA特異的遺伝子については過剰発現体を用い，耐凍性試験によりスクリーニングを行い，野生型植物と比較して耐凍性を示すものを同定する．DA特異的遺伝子については，欠損／抑制変異体を用い，野生型と比較して通常条件での生育が異常を示すもの，または，低温馴化，脱馴化過程における生育・発達が遅くなるまたは，異常を示すものをスクリーニングする予定である．

次年度使用額が生じた理由

（理由）今年度は，ほぼ予定通りに研究費を使用したが，キャンペーン等で安価に購入できた消耗品があり，少額の残額が出た．残額は消耗品費用として使用する予定である．

（使用計画）当初の予定通り，過剰発現体・欠損変異体の作出に加えて，ペプチド人工合成に使用する予定である．

研究成果

• [雑誌論文] AtPep3 is a hormone-like peptide that plays a role in the salinity stress tolerance of plants (2018)
  • 著者名/発表者名: Nakaminami Kentaro、Okamoto Masanori、Higuchi-Takeuchi Mieko、Yoshizumi Takeshi、Yamaguchi Yube、Fukao Yoichiro、Shimizu Minami、Ohashi Chihiro、Tanaka Maho、Matsui Minami、Shinozaki Kazuo、Seki Motoaki、Hanada Kousuke
  • 雑誌名: Proceedings of the National Academy of Sciences 巻: 115 ページ: 5810～5815
  • DOI: 10.1073/pnas.1719491115
  • 査読あり
• [雑誌論文] RNA Regulation in Plant Cold Stress Response (2018)
  • 著者名/発表者名: Nakaminami Kentaro、Seki Motoaki
  • 雑誌名: Adv Exp Med Biol 巻: 1081 ページ: 23～44
  • DOI: 10.1007/978-981-13-1244-1_2
  • 査読あり
• [学会発表] Functional small peptide related to cold respons (2018)
  • 著者名/発表者名: Kentaro Nakaminami, Motoaki Seki
  • 学会等名: 11th International Plant Cold Hardiness Seminar
  • 国際学会 / 招待講演