| 研究課題/領域番号 |
17K07711
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
手塚 武揚 東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 助教 (80646414)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 希少放線菌 / 遊走子 / べん毛 / ブレーキ / プルダウンアッセイ |
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| 研究実績の概要 |
本研究計画は希少放線菌Actinoplanes missouriensisが形成する遊走子を材料として、べん毛運動により水中を高速で遊走する細菌が外界の環境変化に応答して運動を停止する分子メカニズムの全容解明を目的としている。具体的には、遊走子の運動停止に必須のタンパク質として既に見いだしたFtgAの標的タンパク質の同定とFtgAの結合による運動停止機構の解明、およびFtgAの機能発現制御機構の解明を進めている。今年度はFtgAの組換えタンパク質、およびBacterial two-hybrid assayによってFtgAと相互作用することが示唆されていたべん毛タンパク質FliG, FliN, FliIの組換えタンパク質の発現と精製を行った。FtgAとこれら3種のべん毛タンパク質との相互作用をpull-down assayによって解析したところ、FtgA-FliN間およびFtgA-FliI間で相互作用を示す結果が得られた。この結果はFtgAがべん毛タンパク質に直接結合することで遊走子の運動停止時にべん毛の回転運動を停止させることを示唆する重要な成果である。ただし、pull-down assayで検出された相互作用は非常に微弱なものであったため、今後Surface plasmon resonance解析により結合の強度の定量を行い、FtgAによる相互作用のより詳細な解析を進める予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
FtgAとべん毛タンパク質FliN, FliIとの相互作用については研究の進展が見られたが、in vivoでの相互作用解析やタンパク質の結晶構造解析、およびftgAの発現制御機構についての解析は実施できておらず、研究計画にやや遅れが見られる。FtgAの組換えタンパク質を発現、精製することには成功しているため、今後はこの組換えタンパク質を用いて抗FtgA抗体を作製し、pull-down assayやウエスタンブロット解析を進め、研究計画の完了を目指す。
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| 今後の研究の推進方策 |
FtgAとFliG, FliN, FliIとの相互作用解析については、pull-down assayで検出された相互作用が微弱なものであったため、抗FtgA抗体を作製してウエスタンブロット解析を併用することで検出感度の向上を行う。並行してSurface plasmon resonance解析による相互作用強度の定量を進めるとともに、部位特異的変異導入によりFtgAとべん毛タンパク質との相互作用に重要な残基の同定を行う。また、FtgAの発現制御機構についても転写解析、ウエスタンブロット解析を行って、ftgAの発現時期を特定する。
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