| 研究課題/領域番号 |
17K07724
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| 研究機関 | 高知大学 |
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研究代表者 |
加藤 伸一郎 高知大学, 教育研究部総合科学系生命環境医学部門, 准教授 (60346707)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | トレーサー / 硫黄代謝 |
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| 研究実績の概要 |
偏性嫌気性細菌であるClostridium acetobutylicumのタンパク質の合成をクロラムフェニコールにより阻害した。これにL-[35Ｓ]システインをトレーサーとして加え、硫黄の転移反応に関与するタンパク質の網羅的な検出を試みたところ、35Ｓにより特異的に放射標識されるタンパク質バンドがオートラジオグラフィーにより複数見出された。そのうち分子質量16kDaのバンドはNifU様タンパク質であることが同定された。NifU様タンパク質は鉄硫黄クラスターの形成に関与することがこれまでに報告されている。このバンドの35Ｓ放射標識はトリス（2-カルボキシエチル）ホスフィン処理により消失することから「ペルスルフィド構造」を有していると考えられた。詳細な硫黄転移反応の解析をin vitroで行うために当該タンパク質の高発現用プラスミドpECAC3292を調製し、大腸菌を用いてタンパク質試料の取得を試みた。標準的な条件にて発現誘導を行ったのちSDS-PAGEにより解析したところ、不溶性画分にのみ遺伝子産物と考えられる分子質量16kDaタンパク質の発現が認められたため培養および発現誘導の条件検討を行っている。また、別のアプローチとしてpColdベクターへのサブクローニングも実施しており可溶性の試料として調製を目指している。一方、オートラジオグラフィーでは少なくとも５つの標識バンドが別に検出されており、これらについてはペプチドマスフィンガープリンティング法およびエドマン法による同定作業を継続している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
L-[35Ｓ]システインと内在性のシステインデスルフラーゼを組み合わせた硫黄転移反応により、オートラジオグラフィーで35Ｓ放射標識タンパク質を検出することができたが、生成量が少ないため同定作業が困難であり思い通り進まなかった。また、NifU様タンパク質について発現系が構築できたものの可溶性の試料が得られず、in vitroの硫黄転移反応解析実験に予定通り着手できなかった。
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| 今後の研究の推進方策 |
現在遅れている標識バンドのタンパク質同定実験については、実験スケールを大きくして量を確保し引き続き同定を試みる。また、、NifU様タンパク質は培養および発現誘導の条件検討とプロモーターの変更を並行して行い、早期に可溶性の形での試料を調製することを試みる。そしてin vitroで硫黄転移反応を再現し、この過程で必要とされる因子（他のタンパク質、低分子化合物・金属などの補因子等）や条件（pHなど）を検討して硫黄転移反応の最適化を試みる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
研究計画の全体的な遅れがあり、学会参加を取りやめたため旅費に差額が生じた。次年度に遅れている同定実験をスケールアップして再実施する予定であり、それに必要な試薬の購入費用に充てる予定である。
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