| 研究課題/領域番号 |
17K07729
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| 研究機関 | 工学院大学 |
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研究代表者 |
坂口 政吉 工学院大学, 先進工学部, 准教授 (80281351)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | トレハラーゼ / 古細菌 / GH15糖質分解酵素 / トレハロース / 基質認識 |
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| 研究実績の概要 |
サーモプラズマ酵素への変異導入による基質認識残基の検証においては、活性部位を形成している推定の保存配列中、十数種の保存されているアミノ酸に変異導入を施し、触媒活性を調査した。調査したほとんどの変異導入酵素の活性が著しく減少し、触媒作用もしくは活性部位形成に寄与していることが示唆された。そのうち、熱転移温度が減少している変異導入酵素も観察され、酵素全体の構造安定性に寄与しているアミノ酸があることも示唆された。今後、さらに変異導入箇所を広げた調査と、活性減少、もしくは構造安定性に寄与するアミノ酸を類似アミノ酸に変換した調査を実施する。
クレン古細菌スルフォロバス菌から取得した二種の酵素は特異的にトレハロースを分解する活性を示したが、トレハロースに対する親和性と触媒定数に違いがある。SaTreH1(saci1816遺伝子産物)は触媒定数が高く、親和性が低い。SaTreH2(saci1250遺伝子産物)は触媒定数が低く、親和性が高い。両者の同一性は44%程度であり、推定上、活性部位を形成する領域(保存領域)ではよく似ている。上記のサーモプラズマ酵素などとの一次構造アライメントから、SaTreH2特有のアミノ酸を数カ所前者のアミノ酸に変換した調査を試みたが、活性向上および親和性の減少は得られなかった。一方、SaTreH1で対応するアミノ酸をSaTreH2特有のアミノ酸に変換したところ、活性が減少するアミノ酸を特定できた。このアミノ酸をサーモプラズマ酵素に導入すると、同じように活性が減少する結果も得た。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
平成30年度は、既報酵素と新規酵素への変異導入による基質認識残基の検証、酵素を用いたオリゴ糖の合成検討、酵素の結晶化検討が主な計画であった。
クレン古細菌スルフォロバス菌からトレハロースに対する親和性や加水分解活性が異なる二種の新規トレハラーゼを同定し、まとめた原著論文が受理された。
サーモプラズマ酵素2種、スルフォロバス酵素2種、そして既報のマイコバクテリウム酵素の一次構造を比較し、保存されている電荷アミノ酸とトリプトファンを調査継続中である。これまで活性寄与、構造安定性に寄与しているアミノ酸を数個特定できている。特に、活性部位を形成していると推定している5つの保存領域のうち、これらのアミノ酸は保存領域1に集中している結果を得ている。しかし、トレハロースに対して親和性が高く、活性が低いスルフォロバス酵素の特徴的なアミノ酸は同定できていない。この点は結晶化への条件検討と解析により、立体構造からの検証も進めていく。
これら酵素の立体構造のドメイン構造は、同じGH15ファミリーの細菌グルコアミラーゼを基にすると、N末端ドメインとC末端触媒ドメインと推定される。サーモプラズマ酵素のN末端ドメインのN末端10残基を欠損すると不溶性タンパク質として得られ、5残基欠損では活性をもつ可溶性酵素として得られる。また、N末端ドメインを単独発現した場合でも、10残基欠損すると不溶性タンパク質となった。このアミノ酸領域のうち、可溶化タンパク質へのフォールディングに寄与するアミノ酸を同定した(論文投稿準備中)。
オリゴ糖合成は、スルフォロバス酵素の触媒残基を変換した酵素を作製し、フッ化糖とグルコースを出発材料としたオリゴ糖合成を予備的に実施した。現在、トレハロースと、移動度が異なるオリゴ糖を検出している。今後、再現性を得ると共に、他の単糖でも試みる。
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| 今後の研究の推進方策 |
既報のマイコバクテリウム酵素、そして我々が取得したサーモプラズマ酵素2種、スルフォロバス酵素2種に保存されているアミノ酸の役割を継続調査する。既に影響があったアミノ酸に関しては、類似アミノ酸に変換して調査する。スルフォロバス酵素の特徴の違いについては、クレン古細菌酵素同士でアミノ酸変換を実施する。そして、結晶構造解析より役割を補完する。ファミリーが異なる既報のトレハラーゼより親和性が低いこれら酵素の本来の基質を探求すべく、また新奇なオリゴ糖を創製すべく、触媒残基を変換した酵素を調製し、フッ化糖などを開始糖に、グルコースや他の単糖と合成反応を実施する。合成されたオリゴ糖を基質として特性も評価したい。
GH15ファミリーの糖質分解酵素はN末端ドメインとC末端の触媒ドメインで構成される。古細菌トレハラーゼも似たようなドメイン構成を持つと推定している。しかし、N末端ドメインの機能に関する知見がないため、N末端ドメインがどのような多糖と相互作用するか調査する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
他の外部資金が採択されたため、本科研費の次年度使用額に変化が生じた。
塩基配列の解析、DNA オリゴヌクレオチドプライマーの合成、DNA抽出キット、タンパク質精製樹脂、酵素活性解析試薬、オリゴ糖合成基質、結晶化条件検討キットの購入を予定している。
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