| 研究課題/領域番号 |
17K07730
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| 研究機関 | 東洋大学 |
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研究代表者 |
鳴海 一成 東洋大学, 生命科学部, 教授 (90343920)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | DNA修復 / 放射線抵抗性細菌 / DAN損傷誘導性 / ゲノム2本鎖切断修復 |
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| 研究実績の概要 |
放射線誘導性タンパク質DdrA及びそのパラログDdrAPの構造機能解析の一環として、D. radiodurans ddrA ddrAP二重遺伝子欠失株を作製し、PCRによって標的領域の完全欠失を確認した。野生株及びこれまでに作製した3種類の欠失変異株（ΔddrA、ΔddrAP、ΔddrA ΔddrAP）を用いて、薬剤感受性試験を行った結果、ddrAP遺伝子欠失株と二重欠失株はブレオマイシンとノボビオシンに耐性を示した。また、ddrA欠失株は紫外線とナリジクス酸に僅かに感受性を示した。ddrAP遺伝破壊株は紫外線感受性を示さなかったが、二重欠失株はddrA欠失株以上の紫外線感受性を示した。さらに、3種類の遺伝子欠失株のメタンスルホン酸メチル、メタンスルホン酸エチル及び過酸化水素に対する耐性は野生株と同程度であった。これらの結果から、DdrAはDNAジャイレースのサブユニットA、DdrAPはDNAジャイレースのサブユニットBとそれぞれ相互作用することが示唆された。タンパク質の精製については、D. geothermalis ddrA構造遺伝子領域をPCR増幅したものをpET16a及びpET23bベクターにクローニングし、5’領域にHisタグを付けたddrA遺伝子、3’領域にHisタグを付けたddrA遺伝子を作製し、それぞれについてpET9aを用いてベクター交換を行い、カナマイシン耐性マーカーを持つ発現プラスミドを作製した。これらのプラスミドを用いて大腸菌BL21(DE3)をpLysSプラスミドと共に形質転換することで、発現系を構築した。IPTG誘導でタンパク質誘導した結果、N末端のHisタグを付加したDdrAタンパク質は不溶性の沈殿を形成し大量生成が困難であったが、C末端のHisタグを付加したDdrAタンパク質は易溶性で、TALONカラムを用いて大量精製することに成功した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
D. radiodurans ddrA遺伝子及びddrAP遺伝子に関する3種類の欠失変異株の作製が完了し、各種薬剤に対する感受性試験も完了した。また、タンパク質の発現及び精製についても一定の目処が付いたことから、当初の計画どおり研究が進んでいる。
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| 今後の研究の推進方策 |
現在、C末端のHisタグを付加したDdrAタンパク質を抗原として、抗DdrAタンパク質ポリクローナル抗体を作製中である。今後、この抗体を用いてウエスタンブロット解析を行い、細胞中におけるDdrAタンパク質の誘導について調べる予定である。また、DdrAタンパク質、DdrAPタンパク質がともにDNAジャイレースと相互作用することを示唆するデータが得られたため、2019年度にはDdrAタンパク質とDdrAPタンパク質同士の相互作用、さらにはDNAジャイレースと相互作用することが知られているDNA修復促進タンパク質PprAとの関係についても調べる予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
抗DdrAタンパク質ポリクローナル抗体がまだ取得できていないため、ウエスタンブロット解析に要する物品費を次年度に使用する必要が生じた。当該抗体を2019年度に取得した後に、ウエスタンブロット解析に要する物品費を2019年度に請求した助成金と合わせて使用する計画である。
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