2019 年度実施状況報告書

硝酸塩とNOの生理的ダイナミクスの解明と創薬基盤開発

研究課題

研究課題/領域番号	17K07744
研究機関	東北大学
研究代表者	日高將文東北大学, 農学研究科, 助教 (00584848)
研究期間 (年度)	2017-04-01 – 2021-03-31
キーワード	X線結晶構造解析 / タンパク質工学
研究実績の概要	硝酸イオン濃度変化センサータンパク質sNOOOpyは、根粒菌の持つNasSとNasTの2種類のタンパク質を用いたシステムであり、細胞内の硝酸イオン濃度変化をリアルタイムに可視化することができるシステムである。本研究は、sNOOOpyを用いた生細胞内硝酸イオン濃度の生理的変化をとらえることを目的とした研究である。本研究は大きく2つのテーマを設定しており、（テーマ１）sNOOOpyを高感度化し、細胞内の微量な硝酸イオン濃度変化を可視化することを目的として、タンパク質工学的手法を用いたsNOOOpyの改良を試み、（テーマ２）その結果を応用して生細胞内の硝酸イオン濃度変化をとらえる。三年目の研究では、主にテーマ１に取り組んだ。二年目までの研究では、sNOOOpyにどのような変異を導入するべきかを探るべく、sNOOOpyを構成するタンパク質の一つであるNasSのX線立体構造解析を試み、NasSの硝酸イオン、亜硝酸イオンの認識機構を明らかにすることができたが、今年度はNasSとNasTの複合体構造、ならびに蛍光タンパク質が付加した状態のNasS、NasTの結晶化を試みた。Akta startを導入し、タンパク質の精製効率の向上を図ったが、結晶を得ることができなかった。 sNOOOpyの生化学的な知見を獲得するため、様々な条件における複合体の形態を解析したところ、高濃度のタンパク質条件下では3量体以上の多量体を形成していることが分かった。巨大複合体の形成はsNOOOpyの感度の低下に直結することから、多量体形成を指標としたシステムの改良が期待できる。（テーマ１）の実施に時間を要しているため、（テーマ２）については十分な検証ができていないことから、研究期間を延長して実施する予定である。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 3: やや遅れている理由本研究で設定している2つのテーマ、（テーマ１）sNOOOpyを高感度化し、細胞内の微量な硝酸イオン濃度変化を可視化することを目的として、タンパク質工学的手法を用いたsNOOOpyの改良を試み、（テーマ２）その結果を応用して生細胞内の硝酸イオン濃度変化をとらえる、のうち、三年目はテーマ１に重点的に取り組んだ。その過程で、これまで予想していなかった、高濃度タンパク質条件下では多量体が形成されることが分かり、研究方針を転換する必要が生じたため、（テーマ２）への着手が遅れている。
今後の研究の推進方策	本研究で設定している2つのテーマ、（テーマ１）sNOOOpyを高感度化し、細胞内の微量な硝酸イオン濃度変化を可視化することを目的として、タンパク質工学的手法を用いたsNOOOpyの改良を試み、（テーマ２）その結果を応用して生細胞内の硝酸イオン濃度変化をとらえる、のうち、テーマ１に関しては、これまでの研究に引き続きNasSおよびNasTのX線立体構造の解析と、その結果に基づく変異体の設計を試み、sNOOOpyシステムの高感度化を目指す。また、新たなコンセプトとして、NasSとNasTの形成する複合体状態を解明し、今後の開発の指標とする。テーマ２に関しては、テーマ１より新たに作製される改良型sNOOOpyを用いて、細胞内硝酸イオン濃度および亜硝酸イオン濃度変化の検出を試みる予定である。
次年度使用額が生じた理由	（理由）三年目までの研究では、X線結晶構造解析の研究が進み、その結果実験を行うため高エネルギー加速器研究機構までの旅費が多くなった。一方、消耗品を多く必要とする生細胞関連実験のスタートを遅らせたため、結果的に物品費の支出が当初の見込みよりも少なくなった。（使用計画）今年度以降は、消耗品を使用する研究が増えるため、必要となる研究費は当初計画の通りとなると考えている。