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本年度は、申請者が好熱好酸性アーキアより見出した色素依存性L-乳酸脱水素酵素 (Dye-LDH) の大腸菌、アーキアのそれぞれを宿主とする組換えタンパク質発現系を構築し組換えタンパク質の大量発現系の確立を行った。大腸菌による組換えタンパク質の発現は、発現タンパク質が大腸菌内で封入体を形成してしまったため活性を有したDye-LDHを回収することができなかった。一方、アーキアを宿主とするタンパク質発現では、宿主であるアーキア細胞内でDye-LDH活性を有した状態で発現させることに成功した。そこで、さらに大量の組換えタンパク質を宿主内で得るために、3種類の転写活性の強さの異なるプロモーター制御化でDye-LDH遺伝子の発現をアーキア宿主細胞内で行い組換えタンパク質発現の最適化を行った。その結果、この3種類のプロモーターのうち、Dye-DLDHの発現に最適なプロモーターを見出すことに成功した。この構築したアーキアを宿主とするDye-LDH発現系を用いて組換えタンパク質の発現を行い、精製法の検討を行った。その結果、本酵素を2段階の簡便な精製方法で単一に精製することに成功した。この精製酵素を用いて酵素の詳細な性質の解析を行ったところ、本酵素は二つの異なるサブユニットからなるヘテロ多量体構造を有していることが解った。本酵素をコードする遺伝子は3つの機能未知遺伝子とクラスターを形成しているが、精製タンパク質から得られた二つのサブユニットは、Dye-DLDHタンパク質と本酵素遺伝子とクラスターを形成している遺伝子産物であった。さらに、精製酵素の詳細な酵素化学的性質を解析したところ、本酵素は高い耐熱性を有しており今後検討する酵素機能電極用素子として有用であることが明らかとなった。
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