| 研究課題/領域番号 |
17K07757
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| 研究機関 | 広島大学 |
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研究代表者 |
矢中 規之 広島大学, 生物圏科学研究科, 准教授 (70346526)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | ゲノム編集 / GDE5 / コリン / グリセロホスホコリン |
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| 研究実績の概要 |
2017年度に引き続き，exon 11をloxPで挟んだ遺伝子座を持つGDE5 floxマウスの作出を行なった．guide RNA を改良し，PITCh法を用いることでexon 11領域の両端にloxP配列を有するマウスの樹立に成功した．肝実質細胞でCreリコンビナーゼを発現するAlbumin Cre (B6.Cg-Tg(Alb-cre)21Mgn/J)マウスを入手し，交配を行うことでAlb cre+/-, GDE5 flox/floxマウスを取得した．Alb cre+/-, GDE5 flox/floxマウス（肝臓特異的GDE5欠損マウス），および同腹の対照マウス（Alb cre-/-, GDE5 flox/flox）を用いて，肝臓におけるGDE5の発現をexon 11を含むmRNA解析，およびタンパク質解析した結果，GDE5遺伝子の発現量の低下、または消失を確認した．さらに肝臓特異的GDE5欠損マウスを正常食を用いて飼育を行い、肝臓内コリン代謝物濃度などをLCMS法によって解析を行った結果，GPCの有意な上昇が認られた．
さらに，実験室酵母と清酒酵母の交雑株のcholine、およびGPCの蓄積量を解析し，cholineやGPCの高蓄積酵母を探索するとともに、QTL解析によってcholine、およびGPCの高蓄積に寄与する遺伝子座の検索を行った．その結果，choline、およびGPCは量的形質を示すことが明らかとなり、その蓄積に寄与する遺伝子座をマイクロサテライトDNAマーカーとWinQTL Cartographerを用いて、cholineとGPCの蓄積量に関するQTL解析を行った結果，GPCの蓄積に関する有意なQTLが12番染色体上のDNAマーカーであるG1LTSNP3（600,019~822,592）近傍に見出された．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
標的遺伝子であるGDE5遺伝子のexon 11をloxPで挟んだ遺伝子座を持つGDE5 floxマウスの作出を199mer ssDNAとともにCas9を受精卵に導入することで試みていたが，guide RNA の改良においてのみでは極めて困難であった．しかし，研究協力者である佐久間哲史博士（広島大）と中川佳子博士（熊本大）らとともにPITChシステムを用いることでGDE5 floxマウスの作出に成功し，Alb creマウスと交配することで肝臓特異的GDE5欠損マウスの樹立まで達成した．
さらに，実験室酵母と清酒酵母の交雑株のcholine、およびGPCの蓄積量の解析，およびマイクロサテライトDNAマーカーの解析を通して，GPCの蓄積に関する有意なQTLが12番染色体上に存在することを明らかにした．
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| 今後の研究の推進方策 |
Alb cre+/-, GDE5 flox/floxマウス（肝臓特異的GDE5欠損マウス），および同腹の対照マウス（Alb cre-/-, GDE5 flox/flox）を用いて，肝臓内コリン，GPC濃度，およびリン脂質濃度の解析を行う．さらに，choline欠乏食や高脂肪食を摂取させた際の肝障害マーカー，血中脂質，血中コレステロール値についての生化学分析を行う．また，肝臓よりRNAを調製し，DNA microarray法を用いて網羅的な遺伝子発現解析を行う．さらに，骨格筋特異的GDE5欠損マウスの樹立にも着手する．
また，酵母のGPCの蓄積量に関するQTL解析結果で示されたG1LTSNP3（600,019~822,592）近傍において，Sake yeast genome database（SYGD）の情報を用いて、QTL領域に含まれる遺伝子を探索する．特にGPC、およびcholineの代謝に関与する既知遺伝子のみならず，open reading frameを有する未知遺伝子についてもその詳細を解析する．
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| 次年度使用額が生じた理由 |
標的遺伝子であるGDE5遺伝子のexon 11をloxPで挟んだ遺伝子座を持つGDE5 floxマウスの作出についてPITChシステムを用ることで早期に達成したため．
計画における食餌条件のみならず，高脂肪食，あるいはコリン葉酸欠乏などの他飼育条件の動物実験に要する費用，さらに骨格筋特異的GDE5遺伝子欠損マウスの樹立などに使用する予定である．
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