ウイルス侵入の鍵となる硫酸化の仕組みの解明と阻害剤探索

2017 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 17K07763
• 研究機関: 宮崎大学
• 研究代表者: 水光 正仁 宮崎大学, 理事・副学長 (00128357)
• 研究分担者: 榊原 陽一 宮崎大学, 農学部, 教授 (90295197) ; 黒木 勝久 宮崎大学, 農学部, 助教 (20647036)
• 研究期間 (年度): 2017-04-01 – 2020-03-31
• キーワード: 硫酸転移酵素 / 翻訳後修飾 / チロシン硫酸化 / 分泌タンパク質 / 膜タンパク質 / ゼブラフィッシュ / 活性硫酸 / X線結晶構造解析

研究実績の概要

生体内で働くタンパク質の中には、特定のチロシン残基が硫酸化修飾を受けることで、機能が制御されているものがある。この修飾は、抗原抗体反応、補体カスケード、HIVを含むウイルスの感染等、様々な生命現象への関わりが報告されている。硫酸化修飾を担っているのは、タンパク質チロシン硫酸転移酵素（TPST）である。
平成29年度は、結晶構造解析に成功したヒトhTPST1の論文作成と国際誌への投稿を行った。その結果、Scientific Reports, (2017)に掲載された。hTPST1は、可溶性タンパク質として大量発現させ、その後、反応後生成物である3’,5’-Phosphoadenosine phosphate (PAP)と基質となる補体C4タンパク質からデザインした11残基のペプチドとの共存下で結晶化した。このhTPST1は、hTPST2と同様に、二量体を形成し、その二量体の間につくられる奥深い溝の部分でターゲットとなるタンパク質のチロシン残基部分を結合して、その部分で特異的に硫酸基をつけていることが判明した。
また、真核生物の生体内での硫酸化には、唯一の硫酸供与体である活性硫酸PAPSが必須である。これらのPAPS合成酵素遺伝子は2種類存在する。硫酸化の生理機能を解明するために、ゼブラフィッシュをモデルとした活性硫酸合成酵素(PAPSS)のクローニング・諸性質の検討を行った。その結果、生理的pH条件下において、zfPAPSS１はzfPAPSS2よりもATPに対する親和性が高く最大反応速度が遅く、温度安定性が低いことが明らかとなった。
さらに、ゼブラフィッシュを用いて遺伝子ノックダウン及び2D-DIGEによるPAPSSアイソフォームの生理機能解明を試みた。その結果、PAPSSアイソフォーム遺伝子ごとにそれぞれ差異のある表現型及びタンパク質発現が観察された。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

結晶構造解析に成功したヒトhTPST1の論文作成と国際誌への投稿を行った。その結果、Scientific Reports, (2017)に掲載されたことから。
また、真核生物の生体内での硫酸化には、硫酸供与体である活性硫酸PAPSが必須である。硫酸化の生理機能を解明するために、ゼブラフィッシュをモデルとした活性硫酸合成酵素(PAPSS)のクローニング・諸性質の検討行った。その結果、生理的pH条件下において、zfPAPSS１はzfPAPSS2よりもATPに対する親和性が高く最大反応速度が遅く、温度安定性が低いことを明らかにしたことから。

今後の研究の推進方策

予備実験として、ゼブラフィッシュをモデルとしたTPST遺伝子ノックダウンによる生理機能解析から、TPSTは、胚発生に重要な影響を与えている。また、活性硫酸PAPS合成遺伝子をノックダウンした場合、表現型の異常が顕著に見られた。これらのことから、ノックダウン個体のプロテオーム解析を行うことで、高発現または低発現タンパク質を特定し、硫酸化に係わるタンパク質や代謝制御のメカニズムを明らかにする。

次年度使用額が生じた理由

物品の購入において、より安い価格のものを選択したため。
次年度使用額は、平成30年度の物品購入費として使用の予定。

研究成果

• [国際共同研究] オハイオ州/トレド大学/薬学部(米国)
  • 国名: 米国
  • 外国機関名: オハイオ州/トレド大学/薬学部
• [雑誌論文] Radical scavenging effects of 1-naphtol, 2-naphthol, and their sulfate-conjugates. (2018)
  • 著者名/発表者名: Sugahara, S., Fukuhara, K., Tokunaga, Y., Tsutsumi, S., Ueda, Y., Ono, M., Kurogi, K., Sakakibara, Y., Suiko, M., Liu, M.-C., Yasuda, S.
  • 雑誌名: The Journal of Toxicological Sciences 巻: 43 ページ: 213-221
  • DOI: 10.2131/jts.43.213.
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Effects of human sulfotransferase 2A1 genetic polymorphisms 3 on the sulfation of Tibolone. (2018)
  • 著者名/発表者名: Miller, E., Zalzala, M.H., Abunnaja, M.S, Kurogi, K., Sakakibara, Y., Suiko, M., Liu, M.-C.
  • 雑誌名: European Journal of Drug Metabolism and Pharmacokinetics 巻: - ページ: -
  • DOI: 10.1007/s13318-017-0458-2.
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Sulfation of catecholamines and serotonin by SULT1A3 allozymes. (2018)
  • 著者名/発表者名: Bairam, A.F., Rasool, M.I., Alherz, F.A., Abunnaja, M.S., El Daibani, A.A., Gohal, S.A., Kurogi, K., Sakakibara, Y., Suiko, M., Liu, M.-C.
  • 雑誌名: Biochamical Pharmacology 巻: 151 ページ: 104-113
  • DOI: 10.1016/j.bcp.2018.03.005.
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Regioselective production of sulfated polyphenols using human cytosolic sulfotransferase-expressing Escherichia coli cells. (2017)
  • 著者名/発表者名: Shimohira, T., Kurogi, K., Hashiguchi, T., Liu, M.-C., Suiko, M., Sakakibara, Y.
  • 雑誌名: Journal of Bioscience and Bioengineering 巻: 124 ページ: 84-90
  • DOI: 10.1016/j.jbiosc.2017.02.006.
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Identification and characterization of the zebrafish glutathione S-transferase Pi-1. (2017)
  • 著者名/発表者名: Abunnaja, M. S., Kurogi, K., Mohammed, Y. I., Sakakibara, Y., Suiko, M., Hassoun, E., Liu, M.-C.
  • 雑誌名: Journal of Biochemical and Molecular Toxicology 巻: 31 ページ: -
  • DOI: 10.1002/jbt.21948
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Identification and characterization of the responsible human cytosolic sulfotransferases. (2017)
  • 著者名/発表者名: Kurogi, K., Sakakibara, Y., Suiko, M., Liu, M.-C.
  • 雑誌名: Federation of European Biochemical Societies Letters 巻: 591 ページ: 2417-2425
  • DOI: 10.1002/1873-3468.12767.
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Δ4-3-Ketosteroids as a new class of substrates for the cytosolic sulfotransferases. (2017)
  • 著者名/発表者名: Hashiguchi, T., Kurogi, K., Shimohira, T., Teramoto, T., Liu, M.-C., Suiko, M., Sakakibara, Y.10.1016/j.bbagen.2017.08.005.
  • 雑誌名: Biochimica et Biophysica Acta 巻: 1861 ページ: 2883-2890
  • DOI: 10.1016/j.bbagen.2017.08.005.
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Identification and characterization of 5alpha-cyprinol-sulfating cytosolic sulfotransferases (Sults) in the Zebrafish (Danio rerio). (2017)
  • 著者名/発表者名: Kurogi, K., Yoshihama, M., Horton, A., Schiefer, I.T., Krasowski, M.D., Hagey, L.R., Williams, F.E., Sakakibara, Y., Kenmochi, N., Suiko, M., Liu, M.-C.
  • 雑誌名: The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology 巻: 174 ページ: 120-127
  • DOI: 10.1016/j.jsbmb.2017.08.005.
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Structural basis for the broad substrate specificity of the human tyrosylprotein sulfotaransferase-1. (2017)
  • 著者名/発表者名: Tanaka, S., Nishiyori, T., Kojo, H., Otsubo, R., Tsuruta, M., Kurogi, K., Liu, M.-C., Suiko, M., Sakakibara, Y., Kakuta, Y.
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 7 ページ: 8776
  • DOI: 10.1038/s41598-017-07141-8.
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Human cytosolic sulphotransferase SULT1C3: genomic analysis and functional characterization of splice variant SULT1C3 and SULT1C3d. (2017)
  • 著者名/発表者名: Kurogi, K., Shimohira, T., Kouriki-Nagatomo, H., Zhang, G., Miller, E.R., Sakakibara, Y., Suiko, M., Liu, M.-C.
  • 雑誌名: Journal of Biochemistry 巻: 162 ページ: 403-414
  • DOI: 10.1093/jb/mvx044.
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [学会発表] チョウザメおよびその含有成分の機能性 (2018)
  • 著者名/発表者名: 神力はるな、長濱清子、服部秀美、黒木勝久、築地加代子、水光正仁、榊原陽一
  • 学会等名: 日本農芸化学会2018年度大会
• [学会発表] プロスタグランジン代謝物のプロスタグランジン受容体への作用解析 (2017)
  • 著者名/発表者名: 黒木 勝久、榊原 陽一、Liu Ming-Cheh、水光 正仁
  • 学会等名: 日本農芸化学会関西・中四国・西日本支部2017年度合同大阪大会
• [学会発表] 胆汁酸7位特異的硫酸転移酵素SULT2A8の生理機能解明 (2017)
  • 著者名/発表者名: 下平武彦、黒木勝久、園田真紀子、Ming-Cheh Liu, 水光正仁、角田佳充、榊原陽一
  • 学会等名: 第41回蛋白質と酵素の構造と機能に関する九州シンポジウム
• [学会発表] ミクロソーム局在性フェノール硫酸転移酵素の同定を目指した酵素学的研究 (2017)
  • 著者名/発表者名: 吉瀬仁宣、下平武彦、黒木勝久、水光正仁、榊原陽一
  • 学会等名: 第41回蛋白質と酵素の構造と機能に関する九州シンポジウム
• [学会発表] 小胞体ストレスを軽減する食品成分の探索 (2017)
  • 著者名/発表者名: 杉尾里和、下平武彦、神力はるな、長濱清子、近藤知己、水光正仁、黒木勝久、榊原陽一
  • 学会等名: 平成29年度日本生化学会九州支部例会
• [学会発表] 肥育ホルモン硫酸化活性を有するbovine SULTの同定 (2017)
  • 著者名/発表者名: 石川和希、吉瀬仁宣、下平武彦、水光正仁、黒木勝久、榊原陽一
  • 学会等名: 平成29年度日本生化学会九州支部例会
• [学会発表] Tryptophan由来の尿毒症物質indoxyl sulfateとその関連代謝物の抗酸化活性 (2017)
  • 著者名/発表者名: 堤秀平、菅原進太郎、徳永祐希、志水隼輔、木下英樹、小野政輝、黒木勝久、榊原陽一、水光正仁、安田伸
  • 学会等名: フードサイエンスフォーラム第23回学術集会
• [学会発表] 胆汁酸7位硫酸転移酵素の諸性質検討 (2017)
  • 著者名/発表者名: 下平武彦、黒木勝久、Ming-Cheh Liu, 水光正仁、榊原陽一
  • 学会等名: 第24回日本生物工学会九州支部沖縄大会