| 研究課題/領域番号 |
17K07782
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| 研究機関 | 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 |
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研究代表者 |
森 昌樹 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 生物機能利用研究部門, ユニット長 (50192779)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | イネ / ファイトアレキシン / 転写因子 / ストレス抵抗性 |
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| 研究実績の概要 |
イネのジテルペン系ファイトアレキシン(DP)はいもち病感染やUV、塩化銅処理等のストレスに応答して生合成されること、抗菌活性のみならず雑草に対する成長抑制活性を有することが報告されている。我々は最近、DP生合成のキーとなる転写因子DPFをイネより見出し、DPF高発現イネではDP生合成遺伝子群の転写活性化を介してDPを蓄積するのに対し、DPFノックダウンイネでは根において逆にDP生合成遺伝子の発現レベル及びDP蓄積量がWTよりも低下することを明らかにしている（Yamamura et al., 2015）。
本研究では、上記のストレス応答的なDP生合成がDPFに依存しているのかどうか？という疑問に対し、DPFノックアウトイネを用いて、初年度塩化銅及びUVストレス応答的なDP生合成についてはDPFに依存することを明らかにした。DPFはストレス抵抗性に関与しているか？という疑問に対しては、初年度は紋枯病感染やトビイロウンカ吸汁に対する抵抗性を評価したが、DPFの関与は認められなかった。雑草抵抗性に関与する可能性も考えられたので、初年度はDPの根からの滲出量に差があるかどうか水耕栽培により調べたところ、DPF高発現イネではDP滲出量が増大していることが明らかになった。そこでDPF高発現イネが雑草抵抗性になっているかどうかについて調べている途中である。さらに今後各種DPとストレス抵抗性の対応関係を明らかにするために、種々のDP生合成遺伝子のノックアウトイネを作製中である。初年度はDP生合成初段の2つの酵素遺伝子のノックアウトイネを作製した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
[各種ストレス応答的なDP生合成がDPFに依存しているかどうかの検証]塩化銅及びUVにより誘導されるDP生合成が、DPFに依存しているかどうか検証するために、DPF-KOイネ及びWTに同ストレス処理を行い、DP生合成遺伝子の発現量を定量した。WTイネではDP生合成遺伝子CPS2及びCPS4の遺伝子発現が増大したのに対し、KOイネではほとんど増大しなかったので、塩化銅及びUVにより誘導されるDP生合成は、DPFに依存することが明らかになった。
[病虫害ストレス抵抗性]病害抵抗性への寄与については、紋枯病抵抗性評価を実施したが、WTとKOイネで大きな差は認められなかった。害虫のトビイロウンカの吸汁に対しても同様に抵抗性は認められなかった。
[DPの根からの滲出量の定量]DPの根からの滲出量を水耕栽培を行い定量したところ、OXイネではWTに対しモミラクトンの顕著な増大が認められた。DPの定量は連携研究者の東京大学・生物生産工学研究センター・岡田憲典准教授の協力で行った。
[雑草抵抗性]DPF-OX/KOイネ、WTイネを栽培した水耕液を用いてそれぞれ作製した寒天培地上でイヌビエやシロイヌナズナを栽培し、生育抑制活性を根の伸長で評価した。しかしながらWTに比べ有意な差を見出すことはできなかった。
[DP生合成の初期遺伝子のKOイネの作製]モミラクトン欠損イネ、ファイトカサン欠損イネをそれぞれ作出するために、DP生合成の初期のCPS2, CPS4遺伝子等についてCRISPR/Cas9法によりORFにフレームシフト変異を導入することによりKOイネを作製した。KSL7については形質転換イネを再分化中である。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成29年度に得られた結果をもとにして以下の研究を実施する。
[病虫害ストレス抵抗性]まずいもち病菌感染ストレスに応答してDP生合成が誘導されるが、それがDPFに依存しているかどうかをDPF-KOイネを用いて検証する。つぎに、DPF-OX/KOイネについていもち病菌等を用いて病害抵抗性を評価する。また同様に、イネの害虫であるオカボノアブラムシに対する抵抗性検定を実施する（高知大学手林博士の協力）。
[非生物的ストレス抵抗性] 塩化銅処理及びUV照射に対する抵抗性を検定する。塩化銅処理は、水耕栽培で根から各濃度の塩化銅を吸収させる。UVは植物体に短時間照射する。両処理共に処理後の植物体の生育を比較することにより抵抗性を評価する。
[雑草抵抗性] 寒天培地中にDPF-OX/KOイネを植え、周りにレシーバー植物としてシロイヌナズナやイヌビエを配置するプラントボックス法でアレロパシー活性（生育抑制活性）を評価する。
[DP生合成の初期遺伝子のKOイネの作製]初年度に引き続きCRISPR/Cas9法によりDP生合成初期遺伝子（KSL7,KSL4等）のKOイネを作製し、ホモ型変異が挿入された系統の種子を大量に採取する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
いもち病菌感染ストレスに応答したDP生合成の誘導が、DPFに依存しているかどうかについては昨年度実施を計画していたが、気候のためか温室不具合のためか理由ははっきりしていないが、いもち病感染に適しているはずの夏場に何故か感染実験がうまくいかなかった。また、DP生合成初期遺伝子のKOイネの作製については、4種類の遺伝子について当初1個ずつノックアウトを作製する計画であったが、オフターゲット効果を避けるために、それぞれ複数ターゲットについてノックアウトを作製することに変更したため当初よりやや進行が遅れ気味である。以上が次年度使用が生じた理由であり、本年度は上記2点の積み残し分の遂行等にその分を使用する計画である。
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