| 研究課題/領域番号 |
17K07825
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| 研究機関 | 創価大学 |
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研究代表者 |
久保 いづみ 創価大学, 理工学部, 教授 (40214986)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | マイクロ流路 / ラボディスク / サルモネラ菌 / 抗体固定化ビーズ |
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| 研究実績の概要 |
○食品試料から抽出した食中毒菌をそのまま、ラボディスクで検出した場合の検出限界の確認
本研究計画において、まず、ビーズによる捕捉なしで、食品試料からサルモネラ菌を抽出した。すなわち、固形成分と微粒子である菌を分離する性能を持ったフィルターバックを使用して、食品の固形成分と菌を分離した。その後、パーコールを使用した密度勾配遠心により、食品由来の可溶性成分から菌を分離した。抽出、分離した菌液中のサルモネラ菌をラボディスク上でHot Cell-direct PCR法で検出した場合に検出可能な菌の濃度範囲を調査している。また、培養直後の菌をラボディスク上で検出した場合の検出可能範囲との比較から、食品成分の検出反応への影響について検討している。培養直後に菌の場合には、これまでの検討から50cells/マイクロリットルが検出限界であるので、これとの比較を行っている。
○抗サルモネラ抗体固定化ビーズの調製とビーズによるサルモネラ菌捕集効率の確認
抗サルモネラ抗体をカルボジイミド法でカルボキシル化したビーズ表面に修飾することで、抗体修飾ビーズを調製する条件を検討している。抗体の修飾時間や濃度について検討を行った。また、調製した抗体修飾ビーズを用いて、食品試料から抽出した菌液からサルモネラ菌を捕集する効率の最適化を検討している。抽出した菌液とビーズの反応時における濃度、および割合、さらに反応温度、時間、反応時の溶液のPHなどについて種々の条件での検討を行っている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
フィルターバッグによるサルモネラ菌の抽出実験は、固形食品（肉）、液体（卵液）について行った。また、抽出作業終了後の遠心により回収した菌懸濁液についても、マイクロチューブ中での通常、PCRとラボディスク上でのHot Cell-direct RCRでの実験は終了している。
また抗サルモネラ抗体修飾ビーズ表面にサルモネラ菌を捕集する方法についても、菌の濃度、および反応時間の検討は終了した。
これらの実験に結果の解析を行っているところである。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成２９年度に捕集にビーズを使用せずに行った実験結果について、解析を行う。さらに、ビーズへの捕集実験はすでに終了しているので、サルモネラ菌捕集ビーズについて以下の検討を行う。
１．サルモネラ菌捕集ビーズのラボディスクへの導入方法の検討
サルモネラ菌捕集ビーズをラボディスクのマイクロチャンバー中に効果的に捕捉するため、ビーズの濃度、送液時の液組成、送液のためのディスク回転速度や時間などの条件を調べ、最適条件を確認する。
２．ビーズに捕集したサルモネラ菌のHot Cell-direct PCRによる固有遺伝子増幅の確認
マイクロチャンバー内でHot Cell-direct PCRを行う前に、サルモネラ菌固有遺伝子のPCR増幅にビーズが影響を与えるかどうか、また、影響を与えない条件を調べるため、マイクロチューブ中で、サルモネラ菌捕集ビーズを用いた反応の確認を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当初予定に対して、人件費に大きな支出額の差が生じた。これは、交付が決まってから適切な人材が見つかるまでに予想以上に時間がかかったためである。今年度はすでに、人材を確保できる見通しであるため、差額については今年度の人件費、および謝金として使用予定である。
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