| 研究課題/領域番号 |
17K07854
|
|---|
| 研究機関 | 国立研究開発法人森林研究・整備機構 |
|---|
研究代表者 |
七里 吉彦 国立研究開発法人森林研究・整備機構, 森林総合研究所 森林バイオ研究センター, 主任研究員 (80461292)
|
|---|
| 研究分担者 |
岩崎 崇 鳥取大学, 農学部, 准教授 (30585584)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
|
| キーワード | ゲノム編集 / 直接導入 / スギ |
|---|
| 研究実績の概要 |
ゲノム編集とはゲノムDNAの狙った領域を特異的に改変できる技術である。本課題の目的は、直接導入法により、遺伝子組換え技術を介さずスギ等有用針葉樹種のゲノム編集を行う基盤技術の開発である。直接導入法は動物細胞では広く用いられているが、植物細胞は強固な細胞壁に囲まれているため、効率や再現性の面で問題がある。我々はCPP、特にタバコ培養細胞での効果が報告されている（Kimura et al., 2016, BBB ）ポリヒスチジンペプチド（PHP）に注目し、ゲノム編集要素のスギ細胞への導入を試みている。
本年度は、ゲノム編集要素Cas9にPHPを融合したリコンビナントタンパク質の調製方法を確立し、高濃度（1.2-5.2 mg/mL）のCas9-PHPを調製することが可能となった。このCas9-PHPはゲノムDNA切断活性を保持しており、直接導入試験への利用が可能であることが判明した。さらに、Cas9-PHPはスギの細胞内に移行していることが明らかとなった。ただ、現時点ではゲノム編集によるDNAの改変はみられていない。今後はCas9-PHPの導入量を増やすなどして、ゲノム編集試験を試みる。
これと併行して、スギ細胞へのタンパク質導入効率を定量的に見積もる手法として、アデニル酸シクラーゼ (CyaA) の細胞内への導入を試みた。CyaAは細胞内ATPを基質としてcAMPとピロリン酸を生成することから、cAMPまたはピロリン酸を検出することにより細胞内に移行したCyaAタンパク質のみを定量できる。CyaA-PHPとスギ細胞を12時間共存培養することで、ピロリン酸量の増大が確認されたことから、CyaA-PHPの細胞内への移行が定量化できた。また、減圧処理や界面活性剤の添加によりピロリン酸量の増大が確認されたことから、これらの処理がCyaA導入効率の向上に有効であると推察された。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当初の研究計画通り、ゲノム編集要素の核への移行が確認でき、次年度の実験を計画通り行うことができるため。
|
| 今後の研究の推進方策 |
直接導入によるタンパク質の導入効率を向上させる方法を探索する。Cas9等ゲノム編集に必要な要素を直接導入し、ゲノム編集試験を行う。
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
研究遂行のため、共同研究者と鳥取県鳥取市での打合せを予定していたが、お互いに同じ学会に出席していたことから、会場にて打合せを行うことができた。それにより打合せ回数が減り次年度使用額が生じた。これらは次年度の消耗品費に充てる。
|
