| 研究課題/領域番号 |
17K07940
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| 研究機関 | 長崎大学 |
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研究代表者 |
長富 潔 長崎大学, 水産・環境科学総合研究科(水産), 教授 (40253702)
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| 研究分担者 |
金井 欣也 長崎大学, 水産・環境科学総合研究科(水産), 教授 (40145222) [辞退]
小田 達也 長崎大学, 水産・環境科学総合研究科(水産), 教授 (60145307)
吉田 朝美 長崎大学, 水産・環境科学総合研究科(水産), 准教授 (80589870)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 抗酸化酵素 / 酸化ストレス / プロモーター / 転写制御因子 / 魚病細菌 / flagellin / 細胞培養系 |
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| 研究実績の概要 |
本研究では分子生物学的手法を用い、 魚類抗酸化酵素遺伝子の制御領域の解析並びに酸化ストレス応答に関連する転写制御因子を探索すること、次いで魚類培養細胞株やヒラメマクロファージの初代培養系によってエドワジエラ症の原因菌Edwardsiella tarda (E.tarda) 等の暴露に伴う酸化ストレスに対する抗酸化酵素の応答機構を分子レベルで明らかにすることを目的とした。
本年度は、ヒラメCu,Zn-SOD遺伝子5’-上流領域( －1,124 / －1 )の種々の欠失ミュータントを用いたプロモーター活性解析の結果、E.tarda由来菌体外産生物質 (ECP) 刺激に伴う酸化ストレスにおける本酵素遺伝子の発現調節部位はNF-IL6認識配列 ( －202 / －194 ) であることが推定された。また、クローニングしたヒラメMn-SOD遺伝子5’-上流領域 ( －1,020 / －1 ) をルシフェラーゼベクターpGL3に挿入してレポーターアッセイ系を構築し、種々の欠失ミュータントを用いてプロモーター活性解析を行った結果、本酵素遺伝子の発現調節部位はNrf 2認識配列 ( －551 / －505 ) であることが示唆された。現在、酸化ストレス応答に関連する転写制御因子の探索を進めている。
更に、E.tarda由来ECP等 刺激に伴う両SODのmRNA量の変動についてリアルタイム定量PCRを用いて検証した。その結果、E.tarda由来ECP及びE.tarda強毒株組換えflagellin刺激に伴い、Cu,Zn-SOD mRNA量は有意な増加傾向を示し、Mn-SOD mRNA量は減少傾向を示した。また、抗酸化剤N-アセチル-L-システイン処理による影響を調べた結果、両SOD mRNA量の増減は、E.tarda由来ECP等 刺激による酸化ストレスに起因していることが確認された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
培養細胞株の活性酸素種及びサイトカイン産生能の検討はやや遅れている状況であるが、ヒラメSOD遺伝子の転写制御領域の解析並びにリアルタイム定量PCR法による酸化ストレスに伴うSOD mRNA量の挙動ではいくつかの新知見が得られており、現在、これまでの研究成果を取りまとめて１編論文投稿中並びに１編投稿準備中である。従って、研究は概ね順調に進展している。
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| 今後の研究の推進方策 |
魚類抗酸化酵素遺伝子5’-上流領域の欠失ミュータントを用いてプロモーター活性解析を更に詳細に進めて発現制御部位を明らかにすると同時にゲルシフト解析等により酸化ストレス応答に伴う鍵となる転写制御因子の探索を行っていく。更に、MAPキナーゼに対する特異的インヒビター等を用いて細胞内シグナル伝達系の検討も進めていく。
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