研究課題/領域番号 |
17K08092
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研究機関 | 北海道大学 |
研究代表者 |
大田 寛 北海道大学, 獣医学研究院, 講師 (50431333)
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研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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キーワード | 犬 / 消化管 / オルガノイド / 三次元培養 / 疾患ライブラリー |
研究実績の概要 |
本年度は健常犬の結腸のオルガノイドの培養手法の確立に主眼を置き、内視鏡生検サンプルから結腸陰窩の分離、分離した結腸陰窩の三次元培養を試みた。犬の内視鏡生検サンプルからの結腸陰窩の分離に関しては、5つほどの内視鏡生検サンプル(一つあたり10mg程度)をスタートの材料とし、良好な陰窩の分離を可能とする手法を確立した。現時点では、培養したオルガノイドの生存期間は数日間と短く、三次元培養をする際の培地の組成の改善が必要と思われた。また、培養した犬結腸オルガノイドは、上皮細胞のマーカーであるCytokeratinに陽性、細胞増殖を示すKi67陽性、粘液産生性細胞のマーカーであるをPAS染色陽性であり、腸粘膜上皮を構成する上皮細胞の形質を示すことが示された。一方で、腸の内分泌細胞のマーカであるクロモグラニンには陽性を示さず、上皮細胞の細胞分化については更なる培養条件の改善が必要と考えられた。現時点では犬結腸オルガノイドの培養手法の確立には至っていないが、これまでに試みてきた培養手法を用いて、犬の炎症性結直腸ポリープ症例ならびに直腸腺腫症例それぞれ1例の内視鏡生検組織からオルガノイドの培養を試みた。これらの症例犬由来のオルガノイドは、5日間程の三次元培養後に培地より分離し、凍結保存した。これらの凍結保存した症例の結腸のオルガノイドは、今後培養手法が確立された後に凍結融解し、再度の培養および細胞増殖に用いる予定である。
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現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
当初の予定では、本年度中に十二指腸および結腸のオルガノイドの培養手法を確立する予定であったが、結腸オルガノイドの培養条件の検討に時間を費やしたため、十二指腸オルガノイドの培養条件の検討に至らなかった。
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今後の研究の推進方策 |
結腸のオルガノイドの培養手法を参考に十二指腸オルガノイドの培養条件の検討を行う。また、将来的に症例の生検サンプルの凍結保存材料からのオルガノイドの培養を可能とするために、凍結保存した内視鏡生検サンプルからのオルガノイドの培養も試みる予定である。
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次年度使用額が生じた理由 |
実験開始当初の実験では、オルガノイド培養用の3つの主たる増殖因子(Wnt-3、HGF, R-spondin1)を個別に購入してい実験に供していたが、年度末にこれらの増殖因子を産生する培養細胞を新規に購入する予定であった。しかしながら、実験開始当初に使用していた増殖因子を用いてのオルガノイドの培養条件の検討に予定より時間を費やしたため、培養細胞の新規導入が次年度に持ち越された。
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