| 研究課題/領域番号 |
17K08096
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
都築 圭子 東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 特任助教 (30364251)
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| 研究分担者 |
中山 泰秀 国立研究開発法人国立循環器病研究センター, その他, 研究員 (50250262)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 生体内組織形成術 / 犬角膜内皮細胞 / ハイブリッド犬人工角膜 |
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| 研究実績の概要 |
平成29年度は犬角膜内皮細胞の培養法確立を中心に実験を行った。ヒト角膜内皮細胞の培養法を参考に、peel and digest法およびexplant法による分離培養を行った結果、peel and digest法では犬角膜内皮の分離が不十分であり、内皮細胞以外の線維芽細胞様細胞のコンタミネーションも見られた。一方、explant法では敷石状のコロニーを作る上皮細胞の増殖がみられ、形態学的には内皮細胞が分離・培養されたと考えられた。これらの細胞について、内皮細胞マーカーとしてZO-1よびNa+/K+ ATPase発現を評価したところ、部分的ではあるものの、それぞれ陽性細胞がみられた。しかし、継代を行うと第4-5継代で細胞の肥大とZO-1およびNa+/K+ATPase発現低下がみられ、培養系での内皮細胞の維持は困難であった。今後、未分化性の維持を目的に、bFGF等の成長因子添加を検討する。
一方、これまでの予備的検討で、犬で生体内組織形成術を用いて作製したバイオシートに犬角膜上皮細胞株を播種したところ、良好な接着性を示しバイオシート上に上皮層を形成したが、平成29年度は、手技の簡便化を図るため、犬角膜上皮細胞を予めシート状に培養した犬角膜上皮シートをバイオシートに重層することによりハイブリッド犬角膜上皮・実質構造体の作製を試みた。しかし、シートの形状で角膜上皮シートをバイオシート上に接着・維持することが困難であり、上皮層の作製には細胞を播種するほうが再現性が高いと考えられた。角膜上皮シートを用いた方法については、培養法の改良を加え、平成30年度も引き続き検討する。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
犬角膜内皮細胞の培養法確立が当初予定より遅れており、現在安定して実験に用いる段階に至っておらず、次に予定しているハイブリッド犬角膜組織への進展が滞ったため。
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| 今後の研究の推進方策 |
犬角膜内皮細胞の培養法について、平成29年度では培養が安定せず、ZO-1やNa+/K+ ATPaseの評価が十分行えなかった。一方でExplant法により、内皮細胞を分離はできていることから、アスコルビン酸やbFGFあるいはROCK阻害剤など、内皮細胞の未分化性を維持しながら増殖に貢献する可能性のある添加物質を加え、犬内皮細胞の安定的な培養法を探索する。
また、次年度でも内皮細胞培養が困難である場合は、バイオシート状に犬角膜上皮細胞株を播種し、犬角膜上皮―実質構造体として、移植の安全性と有効性を深層角膜損傷モデルを用いて検討する予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
実験（IBTA）に使用したビーグル犬は共同研究先で供与頂いたため、当初計画で計上していた実験動物の購入費用が大幅に削減された。一方、犬角膜内皮細胞にはbFGFやROCK阻害剤など、多種の成長因子、薬剤を添加する必要性が生じてきたことから、今後、新規に購入を検討する試薬・消耗品の購入に充てる予定である。
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