| 研究課題/領域番号 |
17K08101
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| 研究機関 | 岐阜大学 |
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研究代表者 |
酒井 洋樹 岐阜大学, 応用生物科学部, 准教授 (40283288)
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| 研究分担者 |
村上 麻美 岐阜大学, 応用生物科学部, 助教 (30597125)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 血管肉腫 / TRAIL / 犬 / アポトーシス |
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| 研究実績の概要 |
犬の血管肉腫細胞株に対するTRAILの細胞傷害効果を，市販されている3種類のヒト組み換えTRAIL（大腸菌発現組み換えヒトTRAIL Thr95-Gly281，哺乳類発現組み換えヒトTRAILVal114-Gly281，イソロイシンジッパー構造導入哺乳類発現組み換えTRAIL)を用いて評価した。
方法としてWST-1法を用い，24，48および72時間後に，細胞生存率をプレートリーダにより測定した。その結果，大腸菌発現組み換えヒトTRAIL Thr95-Gly281はほとんど効果を示さなかった。さらに哺乳類発現組み換えヒトTRAILVal114-Gly281ではある程度の効果はあったものの，イソロイシンジッパー構造を導入し，三量体形成を容易かつ強固にしたizTRAILが最も効果があることが明らかになった。
さらに，ウェスタンブロッティングによるCaspase-3およびCaspase-8の開裂による活性化，Caspase-3の基質の一つである，Poly（ADP-ribose）polymerase（PARP）の分解，蛍光顕微鏡下での核断片化の評価およびフローサイトメトリーによるAnnexin V/PIによるアポトーシス解析，PI染色による核断片化細胞の検出及び細胞周期解析を，TRAIL処理後，早期の1-6時間を加え，48時間までで行った。
その結果，形態的変化として核断片化，生化学的変化としてCaspase-3およびCaspase-8の開裂による活性化が観察され，さらにPARPの分解の確認され，また，Annexin V＋/PI-の細胞が増加し，izTRAILで誘導される細胞死は，TRAIL経路の活性化を示すCaspase-8の活性化を介したアポトーシスであることが分かった。また，TRAILは，感作後，数時間という早い時期からその作用を示し始めることが分かった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
目標としていた有効性の高いTRAILの選定ができ，さらにそのTRAILの殺腫瘍細胞効果が細胞内のTRAIL経路を介したアポトーシスであることが分かったから。
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| 今後の研究の推進方策 |
次年度は予定通り，内在性TRAILの誘導物質であるTIC10の犬の血管肉腫細胞に対する細胞傷害効果を検討する。さらに，TRAILの作用を増強するとされるZerumboneの効果も併せて評価する。
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