研究課題
熱ショックタンパク質（Heat shock protein: HSP）は、分子シャペロンとして、タンパク質のフォールディング、リフォールディングに関わり、細胞の生存に関わっている。一方で、HSPは腫瘍細胞において強発現し、腫瘍細胞の生存や腫瘍組織の増大に関連していると報告されている。数あるHSPのうち、HSP70は腫瘍細胞内の様々なタンパク質と結合し、細胞外へ放出されることが明らかにされており、腫瘍診断マーカーや腫瘍免疫療法への応用が期待されている。HSP70と他のタンパク質との複合体は、抗原提示細胞の細胞膜に結合し、細胞性免疫を賦活化することから、HSP70に結合する抗原タンパク質は強力な腫瘍免疫反応を誘導できる可能性がある。本研究ではこれまでに、イヌの乳腺腫瘍におけるHSP70の機能について検討するため、HSP70ノックダウン犬乳腺腫瘍細胞株を樹立した。ノックダウン細胞株では、細胞増殖活性が有意に低下し、さらにドキソルビシンによるアポトーシス誘導が促進される傾向が認められた。さらにcDNAマイクロアレイにより、HSP70ノックダウンにより影響を受ける遺伝子群を同定した。また、組換えイヌHSP70タンパク質を作製し、それを抗原としたウサギポリクローナル抗体を作製した。ポリクローナル抗体を用いて、イヌの乳腺腫瘍組織におけるHSP70の発現について免疫組織化学により解析を行った。さらに、組換えイヌHSP70タンパク質とイヌの乳腺腫瘍のライセートを用いた共免疫沈降法により、HSP70に結合するタンパク質の同定を試みたところ、これまでに細胞分裂に関連するcyclinB1、細胞骨格タンパクであるvimentin、myosin-9、actinを同定した。特に細胞分裂に関連するcyclinB1に着目し、組換えタンパク質を作製し、イヌHSP70との結合性を確認中である。
4: 遅れている
組換えイヌHSP70タンパク質とイヌの乳腺腫瘍のライセートを用いた共免疫沈降法により同定されたcyclinB1の組換えタンパク質作製と精製に時間を要したことに加え、イヌHSP70との結合性が十分に検証できていないため。
cyclinB1の組換えタンパク質作製とイヌHSP70との結合性について、ゲル内沈降反応では確認できなかったため、免疫沈降後のウエスタンブロッティングにより、再度検証する。すなわち、cyclinB1あるいはイヌHSP70にタグ（GSTもしくはHISタグ）を付けた状態で抗タグ抗体による検出を検討する。両分子の結合が確認できれば、イヌの末梢血単核球より分化させた樹状細胞をHSP70-cyclinB1複合体によって刺激し、抗原特異的細胞傷害性T細胞を誘導できるかどうかを検討する。
新型コロナウイルス感染症の拡大により、大学における研究活動に制限が生じ、プロジェクトの進行に遅れが生じたため。
すべて 2021 2020
すべて 雑誌論文 (4件) (うち査読あり 4件、 オープンアクセス 1件)
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