研究課題/領域番号 |
17K08116
|
研究機関 | 麻布大学 |
研究代表者 |
根尾 櫻子 麻布大学, 獣医学部, 講師 (50532107)
|
研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
|
キーワード | 3Dプリンター / 人工肝組織 / 犬 / 再生医療 |
研究実績の概要 |
本研究の目的は、3Dプリンターでイヌの立体人工肝臓を構築することである。これまで我々は、生体外で長期間培養できる肝細胞の作製を試みてきた。しかしながら、肝細胞は単層で培養すると、本来の薬物代謝能を発揮できないばかりでなく、わずか数日しか生存維持ができない。そこで、本研究では3Dプリンター技術を用いて、薬物代謝能を持った生体外肝組織の構築を目指すことを最終目標とした。 平成29年度はまず、細胞ソースと培養基材の検討を行い、3Dプリンターで三次元化するときに最適といわれる、直径500ミクロンの細胞凝集塊を形成するための細胞数を検討した。細胞のソースには、iPSや体性幹細胞を使用する前段階として、犬の初代肝細胞および犬肝がん細胞を用いた。これらの細胞との共培養に必要な細胞の選択として、三次元組織内への血管侵入を果たし、酸素供給が望めると考えられているヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC) および各種サイトカイン産生を見込めるイヌ間葉系幹細胞(MSC)を選び、共培養も試みた。培養基材に関しては、96穴プレートに関して、「PrimeSurface 96U」 (住友ベークライト)と、Nunclon Sphera 96U Bottom Plate (Thermo)の検討を行った。その結果、犬肝がん細胞の場合、犬肝がん細胞:1.0×10~4, HUVEC:0.5×10~4, At-MSC:3.0×10~4で混和して共培養する条件が、凝集塊を形成するために最適であると考えられた。500ミクロンという大型の凝集塊を安定して作成できれば、三次元組織化も順調に遂行することができることが予測できる。肝がん細胞に関してはこれらの条件が整ったことがわかった。
|
現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
現在の進捗状況がやや遅れている点は、犬の初代肝細胞に関して、500ミクロンという大型の凝集塊を作成する最適条件が定まっていない点である。本研究の最終目標は薬物代謝が可能な人工肝組織を作成することである。したがって、犬肝細胞もしくは犬体性幹細胞や犬iPS細胞から分化誘導した肝細胞様細胞をソースとして利用する条件検討を行う必要がある。現状では、犬iPS細胞の入手が簡単ではなく、入手が可能であった犬初代肝細胞を用いて、条件検討を行っている。以前の研究でも、初代肝細胞の生存維持は困難であることが明らかであり、三次元化する際にも、おそらく、肝細胞が生存・維持するためには主に増殖因子(HGF、bFGFなど)やサイトカイン(IL1, 6など)の最適な組み合わせを検討することが、問題を解決する糸口であると考えている。
|
今後の研究の推進方策 |
今後は、まず初代肝細胞とヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC) およびイヌ間葉系幹細胞(MSC)の共培養を行い、さらに増殖因子(HGF、bFGFなど)やサイトカイン(IL1, 6など)を加えることで、500ミクロンの細胞凝集塊を作成できる最適培養条件を整える。作成した細胞凝集塊は、形態観察および定性的、定量的PCRと免疫染色にて、最も肝特異的で普遍的マーカーであるアルブミンの産生などを比較検討する。細胞ソースとしては、現在は初代肝細胞の検討を先行して行っているが、脂肪由来体性幹細胞を肝細胞に誘導することを同時に検討しはじめていることから、これらの細胞の肝細胞への分化誘導条件も検討する。肝細胞への分化誘導効率を評価するために、主に免疫染色にてAFP(初期肝細胞マーカー)やアルブミン、HepPer1(成熟肝細胞マーカー)の発現を、半定量的に測定して肝細胞への分化効率の指標とする。性状を確認した細胞凝集塊は、3Dプリンターを用いて人工肝作製に供する。今後順調に研究が進めば、犬人工肝組織は、創薬の毒性試験に応用が期待でき、動物実験代替法ともなる。「動物実験数の大幅削減」を求める現代社会の動きに対応するだけでなく、「信頼性の高い薬物動態や毒性試験の結果が求められる」という難題に直面している医学・創薬および獣医学研究における有力な解決策の一つになることを目標にして研究を遂行したい。
|
次年度使用額が生じた理由 |
研究に必要な肝細胞(約8万円×2本)の購入を行う予定であったが、国内在庫がなく、年度内に入手できなかったことから、次年度の予算として購入することにしたため、残額が生じた。この残額に関しては平成30年度に適切に使用する予定である。
|