| 研究課題/領域番号 |
17K08143
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| 研究機関 | 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 |
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研究代表者 |
鈴木 俊一 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 生物機能利用研究部門, 主任研究員 (90391581)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | インターロイキン / 自然リンパ球 / ブレビバチルス菌 |
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| 研究実績の概要 |
本年度は、ブタ自然リンパ球の刺激・同定に用いる各種ブタインターロイキン（IL)の合成および精製とその活性の確認を行った。ブタ脾臓またはリンパ節由来のcDNAを用いて、各ILの遺伝子をクローニングし、タグ融合タンパク質として発現するベクターを作製した。SS結合を含むIL-12およびIL-23はCHO/K1細胞を用いた哺乳類細胞培養系、SS結合を含まないIL-18、IL-25、IL-33はブレビバチルス菌を用いた分泌発現系と哺乳類細胞培養系の双方でタンパク質の合成とタグによる精製を試みた。
IL-12およびIL-23は、遺伝子導入を行ったCHO/K1細胞の培地中への分泌がWestern Blottingによって確認され、ILに付加したStrepタグを用いた精製も可能であった。さらに、IL-12はコンカナバリンAで刺激したウシPBMCに対する増殖誘導、IL-23はブタ脾臓細胞に対するIL-17A発現誘導を確認し、合成されたILが活性を持つことを示すことができた。
ブレビバチルス菌による分泌発現系では、培地中への各ILの分泌をWestern Blottingにより確認することができた。各ILに付加したHisタグを用いたカラム精製を行ったところ、夾雑物が多く不十分ではあったが、IL-18(KG1細胞におけるIFNγ発現誘導)とIL-25（ブタPBMCにおけるIL-8発現誘導）の活性を示唆するデータが得られた。IL-33はブレビバチルス菌、CHO/K1細胞ともに合成されていることは示すことはできたが、活性の確認には至っていない。
以上のように、一部合成および精製法の再検討が必要な項目は残っているが、目的としている5種類のILの合成および精製が可能となる見通しを立てることができた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
各種インターロイキンの合成および精製に計画以上の時間を要しているが、見通しを立てることはできており、今後遅れを取り戻すことは可能である。
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| 今後の研究の推進方策 |
早急に各インターロイキンの合成および精製とその活性確認を完了させる。活性を持つブタIL-33の合成が困難となる場合を想定し、市販のヒトIL-33等の利用可能性の検討も進める。
各インターロイキンの準備が整い次第、当初計画通り、RAG2ノックアウトブタ由来の細胞を用いて、自然リンパ球に相当する細胞の同定や単離を実施する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
研究計画の進行がやや遅れ、ブタ自然リンパ球の同定に関わる実験への着手が次年度に繰り越しとなった。自然リンパ球の同定に必要な各種ELISAキットおよび増殖細胞をラベルする試薬の購入を予定している。
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