| 研究課題/領域番号 |
17K08150
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| 研究機関 | 浜松医科大学 |
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研究代表者 |
高久 康春 浜松医科大学, 光尖端医学教育研究センター, 特任助教 (60378700)
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| 研究分担者 |
針山 孝彦 浜松医科大学, 光尖端医学教育研究センター, 特任教授 (30165039)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | NanoSuit / 電子顕微鏡 / 高真空 / EDS元素分析 / 生きたまま |
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| 研究実績の概要 |
電子顕微鏡は、光学顕微鏡では見ることが出来ない極微細な構造を高分解能で観察可能なため、開発・改良を重ねながら様々な分野で用いられてきた。しかし、イメージングに用いる電子線の特性を最大限に引き出すには、顕微鏡内を宇宙ステーション軌道に相当する高真空環境に保つ必要があった。そのため、構成成分の７０-８０％が水である生物試料を観察する場合には、事前の化学固定や脱水・乾燥作業（従来法）が不可欠と考えられ、生きた超微細構造の動的観察は不可能であった。我々は、昆虫が潜在的に備えているバリアー能を模倣・利用するという視点から新しい電子顕微鏡技術（NanoSuit法）を開発し、従来法とは全く異なる「生きたままの電子顕微鏡像」を得ることに成功した。本研究では、この技術を展開し NanoSuit法にEDS元素分析（エネルギー分散型X線分析・Energy Dispersive x-ray Spectrometry：どこにどのような元素が分布しているか、元素ごとにMappingできる測定法）を組み合わせることにより、これまで誰も成し得なかった「微細構造を壊すことなく、電子顕微鏡（FE-SEM）により、生きたまま・濡れたままの状態で高分解能・元素分析を行う新技術 “NanoSuit_EDS法”」の開発を行ってきた。その結果、既に幾種かの昆虫を生きたままEDS解析し、これまでに発見されなかった金属元素の発現を特定した。この元素は生きている個体の針状構造にのみ局在し、従来法で作成した死んだ試料では（試料作成時に消失してしまうため）検出することが出来ない。そこで現在、さらにNanoSuit_EDS法を用い、生きたままの生体表面の元素情報を金属原子を中心にMappingし、超微細構造がもつ生きた機能の解明に取り組んでいる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
これまでの解析から、ヒトスジシマカの幼虫（ボウフラ）では、口吻の毛状構造で特定金属元素が検出されることを発見した。そこで、卵からの発生過程をNanoSuit_EDS法により生きたまま解析し、特定元素の局在がどのように変化して行くのか追跡した。その結果、卵からは標的としている特定金属元素が検出されなかった。また、金属元素が含まれていない環境（蒸留水）で卵をふ化させても、これらの幼虫には金属元素はみられなかった。しかし、野外でボウフラが良く繁殖する場所から採取した水で育てると、１令、２令、３令とステージが進むごとに、金属元素の検出量は有意に増加した。この間幼虫は２回脱皮していること、また、この水自体を元素分析しても高い値の金属元素は同定されなかったことから、検出された元素は、外液の単なる付着に起因するとは考えらず、金属元素を濃縮する機構の存在が示唆された。予想外の展開もあったが、研究の進捗状況は、おおむね当初の計画通りに進んでいる。
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| 今後の研究の推進方策 |
様々な条件下でヒトスジシマカの幼虫を飼育し、どのようにして金属元素の値が上昇していくのかを調べる。例えば、あらかじめ幾種かの金属を含む人工水を作成し、幼虫の生育と金属元素との連関を精査する。また、生きたままの試料を継時的に解析する技術を確立し、昆虫の発生過程における金属濃縮や形態形成の過程を解明する。さらに、ヒトスジシマカの幼虫以外の生物種でも同様のアプローチにより生体と金属元素との連関を探る。一方、高真空環境下における生命維持法の改良も試みる。NanoSuit法の基本原理は、液性の体表面物質を電子線およびプラズマ照射のエネルギーにより溶液中の生体適合物質としての高分子を重合させ、ナノスケールの薄膜を形成するものである。しかし、これまでの手法では短時間であるが、エネルギー照射まで生きた生物試料を真空環境に曝す必要が生じていた。この間の生物へのダメージの軽減を図る為に、これまでの手法にさらなる改良を施す。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
研究の展開により購入する機器を変更することになった。今年度においてプラズマ照射装置の購入を予定している。この装置を用いることで、観察試料のダメージの軽減を図る。また最終年度にあたり、研究をまとめる為に技術補佐員を数名雇用し網羅的にデータを収集する。繰り越した助成金の一部は、論文投稿関連の費用にもあてる。
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