| 研究課題/領域番号 |
17K08169
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| 研究機関 | 岡山大学 |
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研究代表者 |
金尾 忠芳 岡山大学, 環境生命科学研究科, 准教授 (40379813)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 無機硫黄化合物 / 硫黄代謝 / 硫黄酸化細菌 / 酵素化学 / 好酸性細菌 / 酵素の結晶化 / refolding / 構造解析 |
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| 研究実績の概要 |
鉄硫黄酸化細菌の一種 Acidithiobacillus ferrooxidans を研究の対象とし、硫黄化合物を代謝する酵素であるテトラチオン酸ハイドロラーゼ(4THase)につい て詳細な研究を行った。この4THaseは、無機硫黄化合物の加水分解反応を触媒し一部の好酸性微生物にのみ確認されている極めてユニークな酵素である。当該研 究では既に、A. ferrooxidansの4THase遺伝子(Af-tth)を世界で初めて同定し、これを大腸菌組換え発現で得た封入体から活性型酵素を獲得し、その結晶化にも成功した。
得られた結晶を用いて、大型放射光施設SPring-8においてX-線結晶構造解析を行い、その立体構造を決定した。さらに本酵素のユニークな反応メカニズムを解明するために、基質を浸漬した結晶構造解析を行うことにより、活性中心と反応に関わるアミノ酸残基の解析を行った。その結果、基質となるテトラチオン酸を加水分解するアミノ酸残基D325を同定し、これに
部位特異的変異導入した変異酵素（D325N）を作成して、活性が完全に消失することを明らかにした。これらのことから本酵素の反応の第一段階を実証することができた。
また、さらなる構造解析を推進した結果、D325残基の近辺に３つのメチオニン残基（M172, M238, M279）によるMetクラスターを発見し、これが硫黄原子を捕捉している様子を発見した。2019年度はこのMetクラスターに部位特異的変異導入を施し、その機能解析を行った。その結果、M279A変異酵素において活性が消失し、M279が活性に必須の残基であることが分かった。
また、海洋性硫黄酸化細菌SH株の硫黄代謝関連酵素を探索するために、本菌の全ゲノム解析をさらに詳細に行った。その結果、トランスポゾンを含む新たな硫黄代謝関連酵素遺伝子のクラスターを発見した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
2019年度は、Af-Tthの結晶構造解析で発見された、極めて珍しい構造であるMetクラスターの機能解析を中心に行った。M172, M238, M279のそれぞれのメチオニン残基に変異を導入した変異酵素を作成し、活性測定を行った。この結果、M279A変異酵素のみ活性が完全に消失したが、残り２つのシングル変異酵素は活性に影響を与えなかった。したがって、M279は活性に必須の残基であり、残りの２つについては影響がないことが分かった。しかしながら、M172A/M238Aのダブル変異酵素においては活性が消失し、M279と少なくともどちらか１つのメチオニン残基が必要であることが分かった。
本研究と並行して、海洋性硫黄酸化細菌SH株の硫黄代謝関連酵素を探索するため、本菌株の全ゲノム配列の詳細な解析を行った。その結果、トランスポソンを含む硫黄代謝関連酵素と推定される遺伝子がクラスターとして存在していることが分かった。この遺伝子クラスターは近縁のAcidithiobacillus thiooxidans標準株などの全ゲノム配列には発見されず、本菌株が他菌株とは異なる新たな硫黄代謝経路を有していることを示唆した。
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| 今後の研究の推進方策 |
今年度は、極めてユニークなAf-Tthの完全な反応機構の解明を目指す。３つのメチオニンクラスターに捕捉された硫黄原子がどのように硫黄分子（硫黄の８員環）を形成し、酵素から脱離するのか、については現在のところ全くのブラックボックスである。このため、野生型酵素だけでなく、これまでに作成した変異酵素についても結晶構造解析を試みて、これの解明に取り組みたい。
本菌については、遺伝子組み換え技術が依然確立されておらず、この手法の開発に取り組む。homologous expression（同種細胞内組み換え発現）システムを構築することで、硫黄代謝関連酵素遺伝子の本来の機能的な発現を可能にして、これまで推定上の機能しか分かっていなかった様々な遺伝子産物（酵素）の機能の実証を可能にする。
また、これまでに得られた研究成果を論文にまとめ、国際誌への投稿と受理を目指す。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
新型コロナ感染症パンデミックにより、予定していた海外の試薬が購入できなくなったため。2020年度に繰り越し、予定通り発注、あるいは代替品の購入を検討する。
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