| 研究課題/領域番号 |
17K08241
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| 研究機関 | 熊本大学 |
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研究代表者 |
武田 光広 熊本大学, 大学院生命科学研究部(薬), 助教 (90508558)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 認知症 |
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| 研究実績の概要 |
レヴィ小体型認知症患者の脳内では、αシヌクレイン（a-Syn）蛋白質が、可溶性のオリゴマーを経て不溶性線維へと重合すると推定される。In vitroで生成した a-Synオリゴマーは、不溶性線維と異なる二次構造を形成し、高い神経毒性を示す。in vivo において、a-Synオリゴマーが実際に生じているのか、また、どのような構造を形成するのかを解明することは、病態の解明や創薬に向けて極めて重要である。本研究は、13C標識 a-Syn 蛋白質を動物の脳に注入し、13C検出磁気共鳴スペクトロスコピー法（MRS）を用いて、a-Synオリゴマーの生成を検出し、その二次構造情報を得る事を目的とする。
H30年度は、a-Synをマウスの脳神経細胞内に導入する計画を立てていた。動物の脳に電極を刺してパルスを与えることで、タンパク質を細胞に効率よく導入する方法が利用できる可能性を考えた。その展望のもと、電気穿孔法を用いたHeLa S3 細胞に対するa-Synの導入実験を実施した。15N標識したa-Synを細胞に導入後、In-cell NMR測定を行い細胞内に導入されたa-Synを直接観測すした。細胞内に導入したa-SynのNMRスペクトルは、試験管内のものと比べて、化学シフト変化・広幅化が生じていた。これらは、Ｎ末端のアセチル化、細胞内分子との相互作用に由来すると考えられる。
今後、a-Synを生きたマウスの脳神経細胞に導入してスペクトルを得る予定である。そのため、神経培養細胞を用いて導入パルスの強度などの最適化を進める。また、今回得られた培養細胞内のa-Syn のスペクトルは、培養細胞内と生きた個体の神経細胞内の環境が a-Syn に及ぼす影響がどのように変化するかを調べる際に、重要な比較対象となる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
H30年度は、a-Synをマウスの脳神経細胞内に導入する計画であった。当初、マウス脳にa-Synを注入することを計画していたが、培養細胞に対する導入検証を行い段階的に進めていく形に変更した。
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| 今後の研究の推進方策 |
神経培養細胞を用いてパルス強度の検討を行い、電気穿孔法による a-Syn の導入効率の最適化を図る。その後、マウス脳に電極を刺して、13C標識タンパク質を注入し最適化されたパルスを与えて、ＭＲＩによる検出を試す。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当初予定していた膜透過性ペプチドを利用した実験から、電気穿孔法を用いた実験へと内容を変更し、当初予定していたマウス脳への注入実験が次年度に見送る形となった。次年度に行うマウス脳への導入実験に本経費を使用する。
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