| 研究課題/領域番号 |
17K08250
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| 研究機関 | 東京理科大学 |
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研究代表者 |
東 達也 東京理科大学, 薬学部薬学科, 教授 (90272963)
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| 研究分担者 |
佐藤 守 千葉大学, 医学部附属病院, 特任准教授 (20401002)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 分析科学 / 臨床検査 / LC/ESI-MS/MS / ハイスループット化 / 誘導体化 / 25-ヒドロキシビタミンD3 / ビタミンD欠乏症 / アイソトポログ |
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| 研究実績の概要 |
LC/ESI-MS/MSを基盤とする臨床検査 (MS臨床検査) は信頼性と経済性に優れる一方で，スループットが低いという問題を抱えている．そこで，MS臨床検査の社会実装を図るべく，多検体一括測定を基盤にハイスループット化を達成する誘導体化試薬アナログ／アイソトポログと，これらを用いる新規測定手法の開発を検討した．
平成29年度は，血中25-ヒドロキシビタミンD3 [25(OH)D3] を指標とするビタミンD欠乏症のハイスループットMS検査法の開発に取り組んだ．先に我々が開発した誘導体化試薬，DAPTADを用いると，25(OH)D3の高感度かつ高特異的（異性体識別）分析が可能である．そこで，そのアイソトポログ2種 (2H3-及び2H6-DAPTAD) を合成した．次に10 μLの血漿のみで25(OH)D3測定が可能な前処理法，LC/ESI-MS/MS分析条件を確立し，先のDAPTADアイソトポログ3種をこれに組み込んだ．その結果，従来法に比し，感度，精度，正確度，特異性を犠牲にすることなく，分析スループットを3倍，すなわち，LC/ESI-MS/MS測定時間を1/3に短縮することに成功した．当初は，DAPTADのアナログであるDEAPTADとそのアイソトポログも組み込んで，6検体一括測定法の確立を目論んだが，それでは血漿マトリックスの増加による精度・正確度の低下が認められ，実用的ではなかった．このように，次年度以降の研究に活かせる，一括測定における検体数に関する情報も得られた．
さらに，当初の計画にはなかったが，肝胆道系疾患のマーカーである血中一次胆汁酸 (コール酸及びケノデオキシコール酸) の3検体一括定量法を並行して検討した．カルボン酸用誘導体化試薬，DAPPZとそのアイソトポログ2種を合成し，従来法よりも分析時間を1/3に短縮できる測定系確立の一歩手前まで到達できた．また，各種誘導体化試薬の開発，適用拡大などの実験も進めた．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
上述のように，血中25(OH)D3の6検体一括測定は達成できなかったものの，3検体一括測定法を確立し，実用性の試験を含め，全て終えることができた．すなわち，本研究課題の肝である誘導体化試薬アイソトポログの開発とそれを用いた新規測定手法の確立まで到達することができ，そしてハイスループット化，実試料を用いた臨床応用性の確認もできた．この研究については，既に論文化まで終わっている．また，試料のマトリックス効果と関係して，一括測定が可能な検体数に関する知見も獲得でき，これは次年度以降の研究に大いに役立つものと考えられる．
さらに，当初の計画にはなかったが，ビタミンD欠乏症のMS検査法と同様のコンセプトに基づき，肝胆道系疾患診断マーカーである血中一次胆汁酸の3検体一括測定法の構築を試み，大部分が終了した．各種バリデーション試験，アプリケーション試験などを実施すれば，比較的早い時期に方法が完成するものと考えられる．
また，DAPTADの抱合型ビタミンD代謝物分析への適用拡大，新規カルボン酸用誘導体化試薬の開発なども進めることができ，次年度以降の実験に活用可能なツール，知見を得ることができた．
以上を総合し，研究は「概ね順調に進展している」と判断した．
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| 今後の研究の推進方策 |
ビタミンD欠乏症のハイスループットMS検査法の研究において，検体数を増やしすぎると血漿マトリックスによる悪影響が見られることが判明した．そこで，女性ホルモン依存性癌のハイスループットMS検査法として，4検体一括測定法が適切と判断し，指標とするエストラジオール (E2) に対し，4種の誘導体化試薬アナログのセットの開発を目指す．その1つは，従来から用いられているダンシルクロリド (DNSCl) で，2つ目はDNSClのメチル基をエチル基に置き換えたDENSClが適当と考えられる．さらに，これらと同じくスルホニルクロリドを反応活性基とする10-methyl-acridone-2-sulfonyl chloride (MASCl) や，これの10位アルキル鎖長の異なるアナログを合成する．これら各試薬をE2と反応させ，誘導体を調製した後に，感度や特異性，LC挙動を精査し，最適な試薬4種を選択する．次に血漿の前処理法の開発，各種バリデーション試験を実施し，目的の4検体一括E2測定法を完成させる．誘導体化試薬アナログが上手く機能しない時は，DNSClとDENSClのアイソトポログを合成し，別の4検体一括測定法の構築を試みる．
また，血中一次胆汁酸の3検体一括測定法の残りの実験を行い，方法の完成，論文化を目指す．さらには，DAPTADの適用拡大，すなわち尿中抱合型ビタミンD代謝物を指標としたビタミンD欠乏症診断の可能性，新規カルボン酸用誘導体化試薬の開発とそれのMS臨床検査への応用なども同時並行で検討していく．
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| 次年度使用額が生じた理由 |
(理由) 実験にかかる消耗品は当初の計画に基づき必要なものを購入したが，研究が順調に進み，購入する量が予想より少なくて済んだ．このため物品費で差額 (残額) が生じた．一方，LC/MS装置の不具合により，修理が必要となり，当初の計画になかった費用も発生した．これはその他として処理した．また，成果発表のため，4つの学会に出席したが，これにかかる旅費については，特段に理由はないが別の予算 (大学からの研究費) から支出し，残額が生じた．以上のことから，結果として20万円弱の繰越が生じ，これは次年度にて以下に記すように有効に使用する予定である．
(使用計画) 平成29年度の繰越額については，平成30年度分の助成額と合わせて，LC/MS用カラム，LC/MS装置消耗品，合成用試薬，溶媒などの消耗品費として使用する．女性ホルモン依存性癌のMS検査法開発の研究を第一に進め，胆汁酸の多検体一括測定法の実験も同時に継続して行う．平成29年度からの繰越額は主として後者のために使用する．また，昨年度はLC/MS装置の修理が必要になったが，今年度もそのようなことが起こらないとも限らず，万が一，その必要が生じた場合は，繰越額をこれにも充てる．
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