| 研究課題/領域番号 |
17K08277
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| 研究機関 | 岐阜薬科大学 |
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研究代表者 |
神谷 哲朗 岐阜薬科大学, 薬学部, 講師 (60453057)
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| 研究分担者 |
原 宏和 岐阜薬科大学, 薬学部, 准教授 (30305495)
足立 哲夫 岐阜薬科大学, 薬学部, 教授 (40137063)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | SOD3 / エピジェネティクス / FOXO1 / 細胞遊走 |
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| 研究実績の概要 |
前年度の研究成果をもとに、本年度ではヒト単球系細胞株（THP-1細胞）およびヒト乳がん細胞株（MDA-MB-231細胞およびMCF7細胞）におけるsuperoxide dismutase 3（SOD3）発現制御機構としてのエピジェネティクスの関与を詳細に解析した。前年度では転写因子FOXO1のノックダウンにより、ホルボールエステル（TPA）誘導性SOD3発現増大が抑制されることを見出したため、今年度は、FOXO1の過剰発現プラスミドを作成し、FOXO1過剰発現細胞におけるSOD3発現を解析した。その結果、当初の期待通りにSOD3発現のさらなる亢進が認められた。また、ChIP法によりSOD3遺伝子プロモーター領域におけるFOXO1の結合を解析したところ、TPA処理細胞においてその結合度の増大が認められた。また、本傾向はヒト乳がん細胞株を用いた実験系においても認められた。以上より、FOXO1はSOD3の直接的な転写因子として機能し、その発現を正に制御していると考えられた。一方、FOXO1のメチル化をIP法にて解析したが、有意なメチル化レベルの増大は認められなかった。
次に、ヒト乳がん細胞株におけるSOD3発現へのエピジェネティクスの関与を解析した。前年度では、低酸素環境下のMDA-MB-231細胞におけるSOD3遺伝子のDNAメチル化の変化を検出することができなかったため、DNAメチル化に必要となる鉄イオン添加の影響を解析した。しかし、鉄イオンの存在下においてもDNAメチル化レベルに有意な変化は認められなかった。
また、SOD3発現レベルに応じた細胞遊走能を評価するために必要となる遊走実験の適正化を行った。その結果、MDA-MB-231細胞およびMCF7細胞それぞれの遊走性を適正に評価できる実験系を構築することができた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
平成29年度および平成30年度の成果より、SOD3発現制御機構におけるFOXO1の関与は概ね実証できたと考える。現在、本成果をまとめた論文を執筆中である。
また、SOD3発現レベルに応じたがん細胞遊走性を評価する実験系を適正に構築できた。このことから次年度以降、SOD3のノックダウン細胞におおける遊走実験に効率よく着手できるものと考える。
一方で、低酸素環境下におけるSOD3発現変動に及ぼすDNAメチル化の関与を見いだすことができなかった。これは、低酸素環境下におけるSOD3発現変動が有意ではあるものの劇的な変化ではないことが理由であると考えられたが、その他にヒストンアセチル化あるいはメチル化などの他のエピジェネティクス要因の寄与が大きい可能性が示唆された。
以上、一部期待した成果は得られなかったものの、論文の作成ならびに次年度以降の研究の遂行に向けての実験基盤は確立できたものと考える。
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| 今後の研究の推進方策 |
前年度までの成果をもとに、SOD3発現レベルに応じた細胞遊走能の違いを検証する。また、SOD3発現制御に及ぼすヒストンメチル化（H3K27me3）ならびにその責任タンパク（JMJD3）の関与を詳細に解析する。
細胞の遊走性に関しては、SOD3遺伝子のノックダウンプロトコールならびに遊走実験のプロトコールは確立しているため、早急に着手し、SOD3発現レベルに応じた細胞遊走性を評価する。
SOD3発現に及ぼすJMJD3/H3K27me3の関与に関しては、前年度までにその関与を概ね実証できているため、JMJD3ノックダウン細胞株を樹立し、その影響を解析する。
低酸素環境下におけるSOD3発現変動に関しては、これまでにSOD3発現への関与を見出しているヒストンアセチル化に焦点を絞り解析する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
（理由）平成30年度では、SOD3発現に及ぼすFOXO1の関与を検証したが、その影響を効率よく実証することができた。このため、使用頻度・価格の高いFOXO1抗体および磁気ビーズの使用量を節約することができた。また、本学奨励研究ならびに外部資金を獲得することができたため、当初使用予定の試薬を補うことができたため、次年度へと研究費を繰り越すこととなった。
（使用計画）平成31年度では、がん細胞の遊走実験やターゲットタンパクのノックダウン実験、ChIP実験を予定している。そのため、トランスウェルプレートやトランスフェクション試薬、siRNAおよび抗体試薬の購入に使用する。
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