相互作用化合物に基づくベータバレル型チャネルＶＤＡＣの立体構造と機能の解明

2019 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 17K08296
• 研究機関: 国立研究開発法人理化学研究所
• 研究代表者: 染谷 友美 国立研究開発法人理化学研究所, 生命機能科学研究センター, 上級研究員 (80450401)
• 研究期間 (年度): 2017-04-01 – 2021-03-31
• キーワード: 無細胞タンパク質合成 / チャネル / 相互作用化合物

研究実績の概要

本研究の目的は、ミトコンドリアのベータバレル型アニオンチャネルVDAC1/2/3それぞれの立体構造、特に、細胞死を抑制する相互作用化合物との複合体構造を解明することである。平成31年度は以下の研究を進めた。
(1)　結晶化促進および電子顕微鏡観察を容易にするために有効な抗体断片を取得するため、研究協力者のどどと協力し、昨年度にVDAC1/2/3それぞれの一部領域に対するモノクローナル抗体を作成した。リポソーム再構成VDAC1/2/3をそれぞれ用いた抗体スクリーニングにより、高親和性かつ立体構造認識抗体を生産する複数のハイブリドーマクローンを得た。今年度は、各ハイブリドーマから抗体可変領域遺伝子をクローニングし、構造解析に適した抗体断片（Fab, scFv等）の発現系作成を進め、複合体調製、安定性と性状の評価、複合体結晶化スクリーニングと電顕観察へ進めた。現在までに良好な結晶は得られていないが、抗体断片とVDACの組み合わせを変えて引き続き結晶化スクリーニングを行う。
(2)　平成30年度以降の計画として、共結晶構造解析が計画通りに進展しない場合にNMR構造解析を行う予定であったが、代わりに近年の有力な構造解析ツールであるクライオ電子顕微鏡を利用した構造解析を目指し、昨年度に引き続きクライオ電顕用サンプル調製条件検討を行っている。(1)の各種抗体断片とVDAC1/2/3を組み合わせたサンプルを脂質ディスクへ組み込み複合体のゲルろ過性状評価にて選別し、電顕観察へ進めている。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

共結晶構造解析が計画通りに進展しない場合に行う計画であったNMR構造解析の代わりに、クライオ電子顕微鏡構造解析も行っているが、抗体断片との複合体の安定性に問題がある試料も多いことから調製条件検討に時間を要している。

今後の研究の推進方策

今後は、安定複合体調製条件の調ったサンプルについて、残る共結晶化スクリーニングと電顕サンプルスクリーニングを完了させ、データ測定ができたサンプルについては構造解析を行う。

次年度使用額が生じた理由

予定していた第二の解析法として、大量に試料が必要なNMRから、少量の試料でスクリーニングが可能な電子顕微鏡法へ変更したため、試料調製費用が予定より少額で済んだ。代わりに、クライオ電子顕微鏡単粒子解析による構造解析を開始すると高額な消耗品等が大量に必要となるため、解析用データ測定を始める予定の翌年度へ予算を繰り越した。

研究成果

• [雑誌論文] A distinct lineage of giant viruses brings a rhodopsin photosystem to unicellular marine predators (2019)
  • 著者名/発表者名: Needham DM, Yoshizawa S, Hosaka T, Poirier C, Choi CJ, Hehenberger E, Irwin NAT, Wilken S, Yung CM, Bachy C, Kurihara R, Nakajima Y, Kojima K, Kimura-Someya T, Leonard G, Malmstrom RR, Mende DR, Olson DK, Sudo Y, Sudek S, Richards TA, DeLong EF, Keeling PJ, Santoro AE, Shirouzu M, Iwasaki W, Worden AZ
  • 雑誌名: Proceedings of the National Academy of Sciences 巻: 116 ページ: 20574～20583
  • DOI: 10.1073/pnas.1907517116
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Structures suggest a mechanism for energy coupling by a family of organic anion transporters (2019)
  • 著者名/発表者名: Leano Jonathan B.、Batarni Samir、Eriksen Jacob、Juge Narinobu、Pak John E.、Kimura-Someya Tomomi、Robles-Colmenares Yaneth、Moriyama Yoshinori、Stroud Robert M.、Edwards Robert H.
  • 雑誌名: PLOS Biology 巻: 17 ページ: e3000260
  • DOI: 10.1371/journal.pbio.3000260
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Metastable asymmetrical structure of a shaftless V1 motor (2019)
  • 著者名/発表者名: Maruyama Shintaro、Suzuki Kano、Imamura Motonori、Sasaki Hikaru、Matsunami Hideyuki、Mizutani Kenji、Saito Yasuko、Imai Fabiana L.、Ishizuka-Katsura Yoshiko、Kimura-Someya Tomomi、Shirouzu Mikako、Uchihashi Takayuki、Ando Toshio、Yamato Ichiro、Murata Takeshi
  • 雑誌名: Science Advances 巻: 5 ページ: eaau8149
  • DOI: 10.1126/sciadv.aau8149
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] Structural basis for the binding of histo-blood group antigens to the norovirus capsid protein. (2019)
  • 著者名/発表者名: 染谷友美、染谷雄一、加藤（村山）美幸、桂一茂、村山和隆、白水美香子
  • 学会等名: CBI学会2019年大会
• [学会発表] Structural changes in Cl- pump rhodopsin by time-resolved serial femtosecond crystallography. (2019)
  • 著者名/発表者名: 保坂俊彰、南後恵理子、久保稔、野村高志、中根崇智、染谷友美、岩田想、白水美香子
  • 学会等名: CBI学会2019年大会
• [学会発表] ノロウイルス抗原性決定領域と抗体の複合体構造解析 (2019)
  • 著者名/発表者名: 染谷 友美、村山-加藤 美幸、桂 一茂、坂井 直樹、伊原 健太郎、村山 和隆、白水 美香子、染谷 雄一
  • 学会等名: 第92回日本生化学会大会
• [学会発表] ヒトクローディン-11の立体構造解析に向けたモノクローナル抗体作製 (2019)
  • 著者名/発表者名: 篠田雄大、新屋直子、染谷友美、白水美香子
  • 学会等名: 第92回日本生化学会大会
• [学会発表] 大腸菌無細胞タンパク質合成技術を利用した密着結合タンパク質クローディンファミリー分子の網羅的な大量調製手法 (2019)
  • 著者名/発表者名: 新屋直子、篠田雄大、桂一茂、竹本千重、花田和晴、井上みお、染谷友美、白水美香子
  • 学会等名: 第92回日本生化学会大会
• [学会発表] XFELでみたCl-イオンポンプロドプシンの構造変化 (2019)
  • 著者名/発表者名: 保坂 俊彰、南後恵理子、久保稔、野村高志、中根崇智、染谷友美、岩田想、白水美香子
  • 学会等名: ISSP ワークショップ