ストレス感受性転写因子NPAS4を標的とした神経精神疾患治療薬の開発

2018 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 17K08306
• 研究機関: 名古屋市立大学
• 研究代表者: 日比 陽子 名古屋市立大学, 大学院薬学研究科, 准教授 (70295616)
• 研究期間 (年度): 2017-04-01 – 2020-03-31
• キーワード: Neuronal PAS domain 4 / 精神疾患 / 脳 / プロモーターアッセイ

研究実績の概要

NPAS4は、GABA作動性抑制性神経の発達やシナプス形成との関連が報告される転写因子である。全身性NPAS4遺伝子欠損 (NPAS-KO) マウスが多動、不安関連行動の減少、恐怖記憶の低下、PPIの障害の他、協調運動や運動学習能力の低下を示し、Npas4-KOマウスの脳各部位においてGABA受容体のmRNAレベルが顕著に低下している。また、Npas4はストレス負荷により、グルココルチコイド受容体活性化やNpas4プロモーターの転写開始点付近のCpGアイランドのDNAメチル化亢進を介して発現低下することから、この転写因子がストレス・GABA神経系障害・精神症状発症の関係の鍵であると考えられる。そこで本研究では、Npas4発現低下による精神疾患様行動発現との関わりを解析し、さらにNpas4の発現上昇によるストレス負荷が要因となる精神疾患の発症抑制や治療の可能性を探り、Npas4プロモーター活性を上昇させる化合物を探索し治療に繋げることを目的としている。前年度までに、薬剤性けいれん誘発モデルを用いて、Npas4-KOマウスがけいれんの閾値が低いことを見出し、Npas4はHomer1a転写を介して神経興奮を低下させることを明らかにした。この成果は原著論文として報告された。また、Npas4の発現増加による精神疾患治療薬の開発を目指し、候補化合物を探索している。今年度は、前年度に引き続き、Npas4プロモーターをルシフェラーゼ遺伝子と繋いだプロモーターアッセイ系を用いて市販の活性化合物ライブラリの中からNpas4プロモーター活性を誘導する化合物探索を行い、数種類見出されたNpas4プロモーター活性上昇化合物の中から、最もプロモーター活性上昇度が強い化合物について、薬効からNpas4活性上昇に至る経路を調査するなど検討を行っている。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

平成30年度の目標は、(1)Npas4発現誘導薬物の探索により見出された数種類の化合物についてさらに解析を深め、至適濃度の決定や細胞内シグナル伝達経路の解析を行いNpas4転写上昇のメカニズムを明らかにする。(2)認知機能障害におけるNpas4の役割の解析を目的とし、野生型マウスのAβ誘発性認知機能障害モデルにて、Npas4発現レベルの変動を調べる。またNpas4-KOマウスで同モデルを作成し脳内炎症亢進や認知機能障害発現にNPAS4の有無が及ぼす影響を解析する。脳内炎症亢進の検出には炎症性サイトカインやiNOSの発現上昇を指標とするが、これらの因子の変動の検出が困難な場合には、NF-kBなど炎症誘導因子のmRNAレベル変動を指標とする。
であった。今年度は、所属の異動があり研究環境の整備に時間がかかったため、研究の進行が遅れた。成果としては、Npas4発現誘導化合物探索について、市販の活性化合物ライブラリの中からヒトおよびマウスのNpas4プロモーター活性を上昇させる化合物を数種類見出し、最もプロモーター活性上昇の程度が強い化合物について解析を続けている。Aβ誘発性認知機能障害モデルについては、まだ結果が得られていない。

今後の研究の推進方策

Npas4プロモーター活性を上昇させる化合物探索により、Npas4を発現誘導する候補化合物が数種類得られたので、作用機序を分子生物学的解析により明らかにする。また、Aβ誘発性認知機能障害モデルを用いて認知症とNpas4発現変動の関係を明らかにし、Npas4発現誘導化合物投与の効果を検証する。
(1)Npas4発現誘導薬物の探索により見出された数種類の化合物についてさらに解析を深め、細胞内シグナル伝達経路の解析を行いNpas4転写上昇のメカニズムを明らかにする。また、本化合物の薬効には神経保護作用が知られていることから、Npas4転写上昇と神経保護作用の関係についても調査する。
(2)認知機能障害におけるNpas4の役割の解析を目的とし、野生型マウスのAβ誘発性認知機能障害モデルにて、NPAS4発現レベルの変動を調べる。またNpas4-KOマウスで同モデルを作成し脳内炎症亢進や認知機能障害発現にNPAS4の有無が及ぼす影響を解析する。脳内炎症亢進の検出には炎症性サイトカインやiNOSの発現上昇を指標とするが、これらの因子の変動の検出が困難な場合には、NF-kBなど炎症誘導因子のmRNAレベル変動を指標とする。また、野生型マウスのAβ誘発性認知機能障害モデルにNpas4プロモーター活性上昇化合物を投与し認知記憶障害発現への影響を解析する。

次年度使用額が生じた理由

平成30年度は所属を移り、研究環境を整えるために大幅に時間を要した。そのため研究の進行が遅れた。
次年度は、・Npas4のプロモーターアッセイを行うための遺伝子導入試薬、プレートおよびアッセイ用試薬を購入する。・in vitroにおける免疫組織学的解析のための各種試薬を購入する。・mRNA変動を検出するための、RNA精製用のキット、逆転写酵素、リアルタイムPCR用キットを購入する。・モデルマウス作成のためのマウスおよびアミロイドβペプチドを購入する。また、生化学的解析に用いる各種抗体を購入する。・生体内におけるNPAS4プロモーターのDNAメチル化変動や遺伝子多型を調べるための、ゲノムDNA精製キットやPyroMarkシステム用解析試薬やプレート、オリゴヌクレオチドを購入する。・本研究で得られた成果の公表のため論文投稿費に使用する。。

研究成果

• [雑誌論文] Neuronal PAS domain protein 4 (Npas4) controls neuronal homeostasis in pentylenetetrazole-induced epilepsy through the induction of Homer 1a. (2018)
  • 著者名/発表者名: Shan W, Nagai T, Tanaka M, Itoh N, Furukawa-Hibi Y, Nabeshima T, Sokabe M, Yamada K.
  • 雑誌名: J. Neurochem. 巻: 145 ページ: 19-33
  • DOI: 10.1111/jnc.14274.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Association between CYP2C19 genotype and the additional effect of cilostazol to clopidogrel resistance in neuroendovascular therapy. (2018)
  • 著者名/発表者名: Tajima H, Izumi T, Miyachi S, Matsubara N, Ito M, Imai T, Nishihori M, Shintai K, Okamoto S, Araki Y, Kumakura Y, Furukawa-Hibi Y, Yamada K, Wakabayashi T.
  • 雑誌名: Nagoya J Med Sci. 巻: 80 ページ: 207-215
  • DOI: 10.18999/nagjms.80.2.207.
  • 査読あり