| 研究課題/領域番号 |
17K08327
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| 研究機関 | 姫路獨協大学 |
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研究代表者 |
矢上 達郎 姫路獨協大学, 薬学部, 教授 (00363812)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | アポトーシス / 大脳皮質神経細胞 / カスパーゼ３活性 / 神経変性 |
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| 研究実績の概要 |
我々は、15デオキシ-デルタ12,14-プロスタグランジンJ2 (15d-PGJ2)を含むシクロペンテノン型プロスタグランジンを神経変性疾患メディエイターとして報告してきた。15d-PGJ2の神経細胞毒性に既知受容体は関与しておらず、神経細胞膜上に受容体とは異なる15d-PGJ2膜標的タンパク質の網羅的同定に成功した。今回、我々は膜標的の一つとしてvoltage-dependent anion channel（VDAC）を同定した。VDACはミトコンドリアばかりでなく形質膜にも異所性に局在していることが報告されており、抗VDAC抗体を用いて細胞内（ミトコンドリア膜）とは区別して形質膜VDACの15d-PGJ2神経細胞毒性における役割について検討した。ラット大脳皮質神経細胞において、15d-PGJ2は、MTT還元活性を減少させ、クロマチンを凝集させ、カスパーゼ３を活性化し、アポトーシスを誘導した。VDACはミトコンドリアばかりでなく神経細胞膜上にも局在していることを確認した。しかしながら、膜VDACと15d-PGJ2膜標的タンパク質との共局在は部分的であった。抗VDAC抗体により15d-PGJ2による神経細胞死およびカスパーゼ３活性は部分的ではあるが優位に抑制された。カルボキシル基を有する15d-PGJ2は生理的PHでは負に荷電しており形質膜を透過できないが、そのトランスポーターは未だ発見されていない。今回の結果から膜VDACが15d-PGJ2トランスポーターである可能性が示唆されたが、確証は十分に得られていない。今後、膜標的タンパク質の15d-PGJ2によるアポトーシスへの関与をさらに解析する予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究では、アポトーシス誘導剤として内因性のneurodegenerative mediatorとして報告されている、シクロペンテノン型プロスタグランジン15-deoxy-△12,14-prostaglandin J2 (15d-PGJ2) に着目した。15d-PGJ2はカルボキシル基を有しているため生理的PHでは負に荷電し形質膜を透過できないが、そのトランスポーターは未発見である。我々は15d-PGJ2膜標的タンパク質の一つとしてvoltage-dependent anion channel（VDAC）を見出した。VDACはミトコンドリ外膜に局在し、アポトーシスにおいて重要な役割を果たしていることが知られている。細胞内VDACではなく形質膜上に局在するVDACの15d-PGJ2誘導アポトーシスにおける役割を明らかにするために、形質膜を透過できない抗VDAC抗体を用いて機能解析を行った。抗VDAC抗体によりラット大脳皮質神経細胞初代培養系においても、形質膜上にVDAC発現が検出された。膜VDACと15d-PGJ2膜標的タンパク質は一部の神経細胞で共局在していることが確認された。15d-PGJ2によるアポトーシスに対し、抗VDAC抗体は部分的に保護効果を示した。抗VDAC抗体は15d-PGJ2誘導カスパーゼ３活性を優位に抑制した。以上の結果から、膜VDACは15d-PGJ2の形質膜透過に関与している可能性が示唆された。膜VDACが、15d-PGJ2トランスポーターであることを示す直接的証拠はまだ得ることが出来なかったので、更なる研究が必要である。
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| 今後の研究の推進方策 |
HSPA8は癌細胞表面に発現していることが知られている。我々は15d-PGJ2膜標的タンパク質の一つとしてHSPA8を既に報告している。脳卒中等で増加するHSPA8には神経細胞保護効果が知られているが、同様に増加する抗HSPA8抗体が神経細胞にどのような影響を与えうるのかは不明である。HSPA8が神経細胞の表面にも局在していることを見出しているので、15d-PGJ2によるアポトーシスが膜HSPA8を介しているのか否かを抗HSPA8抗体を用いて解析する計画である。我々の知る限り、中枢神経系において７つの細胞死が報告されている。プログラム細胞死としてアポトーシス、ピロプトーシス、フェロプトーシス、オートファジー様細胞死とネクロプトーシス、事故的細胞死としてネクローシスとオンコーシスが知られている。抗HSPA8抗体による神経細胞死が新規か否かを調べるために、ATPの細胞内含量、ユビキチン-プロテアソーム系以外のタンパク質分解酵素（カルパイン・カテプシン等）、PI取り込み、クロマチン凝集、DNA断片化、形態変化等を指標に今後評価する予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
コロナ禍のため予定していた実験が行えなかったので、次年度に繰り越した。神経細胞を培養するために妊娠ラットおよび培地等を購入する計画である。抗HSPA8抗体による神経細胞死を解析するためにために、ATPの細胞内含量、ユビキチン-プロテアソーム系以外のタンパク質分解酵素（カルパイン・カテプシン等）、PI取り込み、クロマチン凝集、DNA断片化の評価に必要な試薬・キットを購入する計画である。実験を行うための人件費を計上している。研究成果を発表するために学会参加費および出張旅費を計上している。
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