| 研究課題/領域番号 |
17K08389
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| 研究機関 | 名古屋市立大学 |
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研究代表者 |
肥田 重明 名古屋市立大学, 大学院薬学研究科, 教授 (10345762)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 炎症 / アレルギー / 毒素 / サイトカイン / シグナル伝達 / 細菌 |
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| 研究実績の概要 |
黄色ブドウ球菌は皮膚や粘膜に存在する常在細菌である。毒素含む様々な分泌タンパク質を産生することが知られている。またビフィズス菌は大腸内に存在し、恒常性維持に関与すると考えられている腸内細菌の1つである。これらの常在細菌は宿主動物と共生し相互作用によって生体の恒常性維持や疾患発症に寄与していると考えられるがその詳細な分子機構については明らかになっていない。
LPSなどの自然免疫賦活分子変異型の変異大腸菌を用いて、黄色ブドウ球菌及びビフィズス菌由来の分泌タンパク質分子のリコンビナントを作成した。これらの分子について、野生型マウスやTLR2/TLR4遺伝子欠損マウス由来の樹状細胞やマクロファージ、マスト細胞や好塩基球を用いて2型の液性免疫応答への関与について検討した。
これまでに黄色ブドウ球菌由来分子については、２型免疫応答・アレルギー反応促進分子は、複数同定できた。分泌毒素は細胞表面に結合することで、IgEと抗原の免疫複合体やCa2+イオノファーの存在下で、化学伝達分子の脱顆粒やIL-6, IL-13などサイトカイン産生が増強されることなど、複数の分子について論文で報告した。また、自然免疫細胞に存在する受容体センサー分子については、各種シグナル伝達分子阻害剤を用いて、主要なシグナル伝達分子を想定し、現在同定を試みている。また、ビフィズス菌由来分子については、リコンビナントを作成した分子群から、免疫活性化分子や抑制性分子が数種類同定している。ビフィズス菌培養上清にも免疫活性化作用を持つ分子の存在も明らかになったことから、上清をHPLCなどを用いて分画し、来年度中に質量分析などを用いて同定を行う予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
黄色ブドウ球菌およびビフィズス菌は様々な分泌タンパク質を産生することが知られている。LPSなどの自然免疫賦活分子変異型の変異大腸菌を用いて、細菌由来分泌タンパク質のリコンビナントを作成した。これらの分子について、野生型マウスやTLR2/TLR4遺伝子欠損マウス由来の樹状細胞やマクロファージ、マスト細胞や好塩基球を用いて2型の液性免疫応答への関与について検討した。これまでに黄色ブドウ球菌由来分子については、２型免疫応答・アレルギー反応促進分子は、複数同定できた。α毒素が細胞表面に結合することで、IgEと抗原の免疫複合体やCa2+イオノファーの存在下で、化学伝達分子の脱顆粒が増強した。またSSLファミリー分子の1つがマスト細胞を活性化し、脱顆粒やサイトカイン産生を誘導し炎症反応を増強することを報告した。自然免疫細胞に存在する受容体センサー分子については、各種シグナル伝達分子阻害剤を用いて、主要なシグナル伝達分子を想定し、現在同定を試みている。また、ビフィズス菌由来分子については、リコンビナントを作成した分子群から、免疫活性化分子や抑制性の分子が数種類同定している。ビフィズス菌培養上清にも免疫活性化作用を持つ分子の存在も明らかになったことから、上清をHPLCなどを用いて分画し、来年度中に質量分析などを用いて同定を行う予定である。
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| 今後の研究の推進方策 |
本年度は、これまで同定した黄色ブドウ球菌およびビフィズス菌の様々な分泌タンパク質について、マクロファージ、好中球、樹状細胞、マスト細胞、好塩基球などの自然免疫細胞に発現するセンサー分子の同定とそのシグナル伝達経路について、阻害剤やタンパク質ブロットを用いて解析する。センサー分子は、リガンドを固相化したカラムを作成し、結合した分子を質量分析によって同定することを試みる。
また、これらの分子をin vivoで投与することで、生体の免疫反応や細胞性免疫、液性免疫のバランスがどのように変化するか明らかにし、生理的な意義についても解析を行う。
さらに炎症反応をモジュレーションできることから、炎症モデルなどを作成し、これらの分子の影響についても明らかにする。必要に応じて、阻害剤のスクリーニングや抗体を作成し、免疫応答や疾患への影響についても解析を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本年度に作成を予定していた遺伝子変異マウスと新たに追加で遺伝子変異マウスを共同研究先の外部機関から導入するために、マウスの輸送費・微生物検査・検疫費用にかかる経費を平成31年度にまわした。また、ATCCなどから、追加で別の細菌種の購入を合わせて行う。年度末に培養実験、免疫学的解析に必須の純水作成装置などの修理費用が必要となった。
研究計画に大きな変更はないが、遺伝子発現の変化を定量するためのPCRに使用する試薬類、分子生物学的実験に使用する酵素類、タンパク質ブロットやフローサイトメトリーに使用する抗体は、本研究の遂行に必須の試薬であり、数十種類を年間を通じて使用していることから、昨年度に購入しなかった試薬を必要に応じて継続して追加購入する。
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