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2018 年度 実施状況報告書

スフィンゴシン1リン酸(S1P)輸送体によるリンパ球移動の制御機構解明

研究課題

研究課題/領域番号 17K08399
研究機関摂南大学

研究代表者

小林 直木  摂南大学, 薬学部, 助教 (90532250)

研究期間 (年度) 2017-04-01 – 2020-03-31
キーワードCRISPR/Cas9
研究実績の概要

2017年度までの研究において赤血球のS1P輸送体MFSD2Bを同定できたことから、2018年度はMFSD2Bの機能解析系の構築とS1P輸送体阻害剤のスクリーニングに必要となる簡便なS1P輸送体活性測定系の確立を目的として、HEK293細胞を用いた蛍光標識S1P(NBD-S1P)の輸送活性測定を試みた。スフィンゴシンキナーゼを安定発現させたHEK293細胞(HEK293/SphK)にNBD-スフィンゴシンを添加したところ、細胞内でNBD-S1Pが合成されたが、S1P輸送体を発現させていないHEK293/SphK細胞から相当量のNBD-S1Pが細胞外へ放出されることが分かった。この内因性のNBD-S1P放出はMFSD2Bの活性を測定する際にはバックグラウンドを上昇させてしまう。そこで、HEK293/SphK細胞において何らかの内因性の輸送体がNBD-S1Pの放出に関与していると仮定し、NBD-S1P輸送体の探索を行った。多剤排出輸送体として知られているいくつかのABC輸送体をHEK293/SphK細胞に強制発現させたところ、ABCC1発現株においてNBD-S1P放出量が増加した。また、siRNAによりHEK293/SphK細胞のabcc1遺伝子を発現抑制したところ、NBD-S1P放出量が大きく減少した。これらの結果から、HEK293/SphK細胞に発現している内因性のNBD-S1P輸送体はABCC1であることが強く示唆された。そこで、CRISPR/Cas9システムによりHEK293/SphK細胞のabcc1遺伝子を欠損させたところ、HEK293/SphK細胞からのNBD-S1P放出量が大きく減少したことから、ABCC1はHEK293/SphK細胞における内因性のNBD-S1P輸送体であることが分かった。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

HEK293細胞を用いたNBD-S1Pの輸送活性測定が概ね順調に進んだため。

今後の研究の推進方策

HEK293/SphK細胞のabcc1欠損株にMFSD2BなどのS1P輸送体を安定発現させることでバックグラウンドの低い高感度のS1P輸送体活性測定系を確立し、S1P輸送体阻害剤のスクリーニングを進める。

次年度使用額が生じた理由

概ね研究は予定通り進んでいるが、一部の消耗品を2019年度に購入することにしたため。したがって、次年度使用額は消耗品費として使用する。

  • 研究成果

    (6件)

すべて 2018

すべて 雑誌論文 (2件) (うち査読あり 1件) 学会発表 (4件) (うち国際学会 1件)

  • [雑誌論文] 新たに同定された赤血球のS1P輸送体MFSD2B2018

    • 著者名/発表者名
      小林 直木、西(川崎) 晶子、西 毅
    • 雑誌名

      生化学

      巻: 90 ページ: 581~587

    • DOI

      10.14952/SEIKAGAKU.2018.900581

    • 査読あり
  • [雑誌論文] 赤血球における新規S1P輸送体MFSD2Bの同定2018

    • 著者名/発表者名
      小林 直木、西(川崎) 晶子、大塚 正人、久野 悠、山口 明人、西 毅
    • 雑誌名

      脂質生化学研究

      巻: 60 ページ: 200

  • [学会発表] 赤血球における新規S1P輸送体MFSD2Bの同定2018

    • 著者名/発表者名
      小林 直木、西(川崎) 晶子、大塚 正人、久野 悠、山口 明人、西 毅
    • 学会等名
      第60回日本脂質生化学会
  • [学会発表] MFSD2B is a novel sphingosine 1-phosphate transporter in erythroid cells2018

    • 著者名/発表者名
      Naoki Kobayashi, Shoko Kawasaki-Nishi, Masato Otsuka, Yu Hisano, Akihito Yamaguchi, and Tsuyoshi Nishi
    • 学会等名
      2nd Japan-Korea Lipid Joint Symposium
    • 国際学会
  • [学会発表] 赤血球の新規スフィンゴシン1リン酸輸送体MFSD2Bの同定2018

    • 著者名/発表者名
      小林 直木、西(川崎) 晶子、大塚 正人、久野 悠、山口 明人、西 毅
    • 学会等名
      第68 回 日本薬学会近畿支部大会
  • [学会発表] 赤血球前駆細胞株の新規S1P輸送体MFSD2Bの同定2018

    • 著者名/発表者名
      小林 直木、西(川崎) 晶子、大塚 正人、久野 悠、山口 明人、西 毅
    • 学会等名
      第40回生体膜と薬物の相互作用シンポジウム

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公開日: 2019-12-27  

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