| 研究課題/領域番号 |
17K08399
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| 研究機関 | 摂南大学 |
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研究代表者 |
小林 直木 摂南大学, 薬学部, 助教 (90532250)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 蛍光測定 |
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| 研究実績の概要 |
本研究では新規S1P輸送体MFSD2Bの迅速な機能解析系の構築およびS1P輸送体阻害剤のスクリーニングに必要なハイスループットS1P輸送体活性測定系の確立を目指している。蛍光標識したS1PであるNBD-S1Pを用いたS1P輸送体の簡便な活性測定系の構築においては、2018年度までの研究により、HEK293細胞のスフィンゴシンキナーゼ安定発現株（HEK293/SphK）のabcc1遺伝子欠損株（HEK293/SphK abcc1 KO）構築により、細胞外の蛍光強度を測定する際のバックグラウンドを低下させることができた。2019年度は、HEK293/SphK abcc1 KO細胞において、S1P輸送体であるMFSD2B, SPNS2を発現させることにより、これらの輸送体の活性測定が可能であることを確認した。一方で、HEK293/SphK abcc1 KO細胞から放出されるNBD-S1P量を測定する際、NBD-S1Pの前駆体であるNBD-スフィンゴシンを細胞に添加すると、NBD-S1P以外の種々のNBD-スフィンゴシン代謝物が細胞外に見られることが分かった。これらのNBD-スフィンゴシン代謝物由来の蛍光は細胞外NBD-S1P特異的な蛍光を測定する際の妨げとなった。そこで、NBD-S1Pのキャリアとして、元々使用していたBSA以外にS1PキャリアであるHDLおよびApoMを細胞外に添加したところ、いずれのキャリアもNBD-S1Pキャリアとして機能し、特にApoMはNBD-S1Pと特異的に結合することが分かった。NBD-S1PのキャリアとしてApoMを使うことにより、細胞外NBD-S1P由来の蛍光を特異的に検出できることから、蛍光測定による簡便なS1P輸送体活性の測定が可能となった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
所属部局の変更に伴う実験器具・試薬等の移転作業、新型コロナウイルス感染拡大防止措置としての研究活動自粛により遅れが生じた。
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| 今後の研究の推進方策 |
蛍光測定による簡便なS1P輸送体活性の測定が可能となったことから、S1P輸送体阻害剤のスクリーニングに関連する実験を行う予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
所属部局の変更に伴う実験器具・試薬等の移転作業、新型コロナウイルス感染拡大防止措置としての研究活動自粛により研究の進捗に遅れが生じた。次年度使用額はS1P輸送体阻害剤のスクリーニングに関連する実験の経費に充当する予定である。
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