| 研究課題/領域番号 |
17K08432
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| 研究機関 | 近畿大学 |
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研究代表者 |
岩城 正宏 近畿大学, 薬学部, 教授 (30140346)
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| 研究分担者 |
川瀬 篤史 近畿大学, 薬学部, 講師 (80411578)
島田 紘明 近畿大学, 薬学部, 助教 (40783444)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 肝毒性 / 特異体質性肝障害 / 非ステロイド性抗炎症薬 / アシルCoAチオエステル体 / アシルグルクロン酸抱合体 / ミクロソーム / マクロファージ / グルタチオン |
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| 研究実績の概要 |
本研究では非ステロイド性抗炎症薬(NSAIDs)の反応性代謝物の一つで，肝毒性発現に関与している可能性のあるアシルCoAチオエステル(CoA)体の薬物誘発性肝障害発症要因としての寄与の有無を明らかにすることを目的とした。まず，アシルCoA合成酵素(ACS)発現細胞を作成前に，肝ミクロソーム中での種々のNSAIDsのCoA体生成量を明らかにすることを試みた。しかし，イブプロフェン(IBU)およびイブフェナク(IBF)において，現時点でCoA体の生成を検出できていない。一方で，肝毒性への寄与が大きい反応性代謝物として知られるアシルグルクロン酸抱合体(AG体)は，検討したすべてのNSAIDsにおいて生成した。特に，毒性により市場撤退したゾメピラク(ZOM)やIBFでは，加水分解酵素によるAG体の分解阻害により，その他の市販されているNSAIDsと比較してAG体の累積生成量が顕著に増大した。したがって，当初の予定を変更して，毒性の異なる種々のNSAIDsのAG体の肝ミクロソーム中での分解に対する加水分解酵素阻害の影響を検討している。また，CoA体の生成もNSAIDsの種類によって生成量が異なる可能性があるため，継続して検討中である。さらに，薬物誘発性肝障害発症機序の解明に向けたアプローチとして，反応性代謝物の解毒経路（グルタチオン抱合化）およびマクロファージの毒性発現への関与を検討している。マウス肝細胞とマクロファージの共培養系を用い検討を行ったところ，肝細胞/マクロファージ比1 : 0.4での共培養でのグルタチオン枯渇がジクロフェナク (DIC)による細胞障害を増強させた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
当初予定していた代謝酵素発現細胞の作成と毒性評価については未実施であり，やや遅れているとした。しかし，それに先立ち明らかにした下記項目で新たな知見が得られており，今後の検討にも生かせるものと考えている。
グルクロン酸転移酵素(UGT)およびACS発現細胞の構築に先立ち，UGT, ACSによりNSAIDsの各代謝物がどの程度生成されるかラット肝ミクロソームを用いて検討した。グルクロン酸抱合体(AG体)生成に関しては全薬物について検討した。AG生成量やタンパク質との共有結合体形成量はDIC, メフェナム酸 (MEF)においてIBFやZOMよりも多く，肝毒性の強いNSAIDsが必ずしもタンパク共有結合体生成が高いというわけではなかった。CoA体については，IBFとIBUについて検討したが，現在までCoA体がHPLCでは検出されていない。したがって，肝臓中でのCoA体生成量が非常に少ないか、CoA体が不安定で分解されている可能性がある。CoA体については，生成反応条件の変更およびNSAIDsの種類を増やして検討中である。一方，AG体生成に関して，肝毒性の強いIBFやZOMではDIC, IBU, MEFと比較してAG体が酵素による加水分解を非常に受けやすいことが初めて明らかになった。肝細胞/マクロファージ共培養系を用いDICによる細胞毒性におけるグルタチオン枯渇およびマクロファージの関与を調べるため，共培養系でのグルタチオン枯渇条件を検討した後，DIC添加時の反応性代謝物であるDICグルクロン酸抱合体の産生と細胞毒性について検討した。これまでに報告されている炎症条件下の肝細胞とマクロファージ比（およそ1 : 0.4）での共培養条件でグルタチオン枯渇によりLDH漏出量が有意に上昇するとともに細胞内ATP含量が有意に低下することを明らかにした。
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| 今後の研究の推進方策 |
昨年度得られた結果より，毒性の強いNSAIDsほどAG体生成量に対する加水分解酵素阻害の影響が大きいことが初めて示唆された。そこで計画の一部を変更し，毒性の異なる種々のNSAIDsのAG体生成に対する加水分解酵素阻害の影響を検討する。また，現在はβ-グルクロニダーゼ阻害薬とエステラーゼ阻害薬を併用していることから，各々のAG体分解阻害に対する寄与についても検討する。
CoA体生成については現在まで，肝ミクロソーム中では生成が検出できていないため，NSAIDsの種類を増やすとともに，CoA体生成反応条件や反応後の除タンパク条件などを再検討し，その生成を検出する。肝ミクロソーム中でのCoA体の生成が見られ次第，ACS発現細胞の作製に取り掛かる。
共培養系では，これまでグルクロン酸抱合体および水酸化体の測定を行ってきたが，CoA体生成についても測定を試みる。また，DIC以外の薬物についても検討を行う予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
購入した機器（蛍光プレートリーダー）の見積もり額が当該年度の受入分を若干下回り，残高を次年度の細胞培養に関する材料用品費として使用する。
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