| 研究課題/領域番号 |
17K08461
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| 研究機関 | 帝京平成大学 |
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研究代表者 |
石田 功 帝京平成大学, 薬学部, 教授 (00415556)
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| 研究分担者 |
大西 敦 帝京平成大学, 薬学部, 准教授 (50342762)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | フィブリン分解酵素 / ヘビ毒 / 血栓溶解剤 |
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| 研究実績の概要 |
血栓症は、日本においてもその羅漢率・死因率の高さはトップクラスに位置しており、血栓症の予防、治療に関する研究の注目度は非常に高い。血管の梗塞部位の解除には、組換え組織プラスミノーゲン活性化因子（rtPA）の静脈注射は効果的であり、再狭窄についてはGPIIb/IIIa血小板受容体阻害剤により回避が可能とされる。しかしこの手法は、血中プラスミンの活性化による補体の活性化、血小板凝集促進による副作用が問題となる。
ガラガラヘビ毒由来メタロプロテアーゼ断片（Alfimeprase）は、強力なフィブリン塊の分解活性をもつが出血活性はもたず、且つrtPAのような副作用が予想されないため、米国で血栓溶解剤として臨床開発された。しかしながら、生理的条件下において、Alfimepraseは血清中のα2-macroglobulin （α2M）により不可逆的に且つ速やかに不活性化されるため、期待された血栓溶解効果が見られず、第２相臨床試験でドロップアウトした。
本研究で着目した台湾ハブ毒由来タンパク質TM3（Fibrinlysin）は、Alfimepraseのホモログである。Fibrinlysinは、フィブリン塊分解活性はもちα2Mには不活性化されないが、出血活性を持つという欠点がある。出血活性は、毒タンパク質の活性部位周辺に配置される塩基性アミノ酸残基が、基底膜と結合することにより発現すると考えられている。分子モデリングから、Fibrinlysinの活性部位周辺において、出血活性に関わると予想される特徴的な塩基性アミノ酸残基を特定し、出血活性を欠損させたFibrinlysin変異体の作製を行う。さらに、その変異体にヒトプラスミノーゲンクリングルドメイン1（FBD）を融合することにより、フィブリン塊に対して特異的な標的活性をもたせ、プラスミン活性化による副作用のない血栓溶解剤開発の実現を進めていく。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
Fibrinlysinと2種類のホモログ（Alfimeprase, HR2a）のアミノ酸配列を比較した結果、Fibrinlysinにおいて特徴的である4カ所の塩基性アミノ酸残基R85、R106、R116、K133が見つかった。これら4カ所の塩基性アミノ酸残基が、Fibrinlysinの出血活性に関与する可能性が考えられた。その中でも、R106はFibrinlysinの活性中心近傍に配置されていることから、R106のアミノ酸置換は、出血活性だけでなく酵素活性にも影響を及ぼすことが考えられた。そこで、2種類のFibrinlysin変異体、3重変異体（Mutant1：R85T/R116G/K133N）、および4重変異体（Mutant2: R85T/R106G/R116G/K133N）を設計した。分子モデリングにより、野生型と2つの変異体の立体構造を比較した結果、2種類の変異体ともに、野生型Fibrinlysinとの大きな構造の違い、活性中心の変化は見られなかった。
バキュロウイルス発現系を利用して、シグナルペプチドを付加した野生型、Mutant1、Mutant2は全て可溶性タンパク質として培地中へ分泌することが確認できた。しかしながら、精製を進めるに伴って、目的タンパク質は凝集、不溶化した。目的タンパク質が不溶化しないように条件検討を探索しつつ精製を進めたが、現在までに有効な改善方法は見つかっていない。また、3種類の組換えタンパク質の粗精製品を用いてフィブリン分解活性を確認した結果、全てにおいてフィブリン分解活性は確認された。
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| 今後の研究の推進方策 |
Fibrinlysinを含むAlfimepraseのホモログは、ヘビ体内で前駆体として合成され、翻訳後にプロセシングを受け、分泌タンパク質として機能することが分かっている。Fibrinlysin の遺伝子全長を確認した結果、Fibrinlysinは前駆体タンパク質のC末端側にコードされていることから、Fibrinlysin前駆体のC末端側にHisタグを付加した遺伝子を合成し、バキュロウイルス発現系に導入して組換えタンパク質の発現を行う。目的タンパク質は、発現後速やかにカラム精製を行い、それぞれの精製標品についてフィブリン分解活性の確認を行う。フィブリン分解活性を確認した後、ウサギの耳に精製標品を注射することにより、出血活性の有無を調べる。野生型に出血活性があり、Mutant1またはMuant2に出血活性がなければ、その変異体のN末端またはC末端にFBDを付加した遺伝子を合成し、バキュロウイルス発現系で組換えタンパク質を発現、精製する。作製したMutant1（またはMutant2）＋FBDがフィブリン分解活性をもち、且つ出血活性が欠損していることを確認する。さらに、Mutant1（またはMutant2）+FBDがフィブリンコートディスクと特異的に結合することを確認していく。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
目的の組換えタンパク質は、SOSUIから可溶性タンパク質であると予測された。しかし、バキュロウイルス発現系で発現させた組換えタンパク質は不溶性であった。また、目的のタンパク質にシグナルペプチドを付加し発現させると可溶性タンパク質として得られたが、精製を進めるに伴って不溶化する想定外の状況に直面し、現段階では十分量の精製標品を簡単に得ることは困難である。加えて、2020度はCOVID-19の影響により、予定していた研究計画通りに進行ができなかった。Fibrinlysinは、ヘビ体内では前駆体として合成され、プロセシングを受けて分泌タンパク質として機能することから、Fibrinlysin前駆体のC末端にHisタグを付加した遺伝子を合成する。本来の形式に従って目的タンパク質を発現させることにより、可溶性タンパク質として獲得し、研究計画を速やかに進行させていく。
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