| 研究課題/領域番号 |
17K08496
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| 研究機関 | 岩手医科大学 |
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研究代表者 |
木村 英二 岩手医科大学, 医学部, 准教授 (50405750)
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| 研究分担者 |
人見 次郎 岩手医科大学, 医学部, 教授 (00218728)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 血管形成 / 脳血管 / ゼブラフィッシュ / 細胞周期 / Fucci / タイムラプス・イメージング / ライトシート顕微鏡 / IR-LEGO |
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| 研究実績の概要 |
我々は、小型魚類のゼブラフィッシュ（Danio rerio）を用いて、初期の脳血管系がいかにして構築され、その後 どのようにして椎骨動脈系と統合されるか、その全過程を明らかにすることに成功した。そして血管内皮細胞の核で特異的に蛍光を発する遺伝子組み換え体の観察から、初期に頭部灌流血液の静脈路として機能するPHBC（primordial hindbrain channel）から後脳実質を貫き脳底動脈へとループしてつながるCtA（central artery）が萌出する直前に、PHBC を構成する内皮細胞の数が劇的に増加する現象を捉えることに成功した。このことは血管系がその後の血管新生に先んじて内皮細胞の細胞分裂を進行させている、すなわち血管系の形態形成と細胞周期が協調的に制御されていることを示している。そこで本研究課題では、細胞周期を可視化するFucciを血管内皮細胞で特異的に発現するトランスジェニック・ゼブラフィッシュを作成し、得られた胚をタイムラプス・イメージングすることで、脳血管形成過程における細胞周期変化の全容を詳細に解析する。また血管新生因子として最重要な役割を果たしている vascular endothelial growth factor（vegf）遺伝子やその上流に位置すると想定されているsonic hedgehog（shh）遺伝子に着目し、heat shock protein（hsp）プロモーター下流につなげ、Infrared Laser-Evoked Gene Operator（IR-LEGO）を用いた熱応答により発現が誘導できる組み換え体を作成する。局所的な熱応答により時間・空間的に制御した異所的な遺伝子発現を血管周囲の神経組織や脊索で誘導することで、その後の細胞周期への影響を評価する。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
平成30年度には、作成した系統を用いてライトシート顕微鏡によるタイムラプス観察を行った。しかしながら細胞分裂期に発現を認めるはずのGemininに連結した緑色蛍光を十分に観察することができなかった。また29年度に樹立した方法では、同時に3系統を組み合わせたトリプル・トランスジェニック胚を使用する必要があり、すべてのレポーター遺伝子を十分発現している胚の取得がうまくいかない場合があった。これらの問題点を解決するために、より効率的に血管系でレポーター遺伝子を発現させ容易にライン化できる強力かつ長さの短いプロモーターの作成を試みた。すなわちこれまで使用してきたflk1（kdrl）のプロモーターの発現調節に関係しない領域を削り5kbpまで短くしたコンストラクトを作成した。kdrl_shortP:EGFPを1細胞期の受精卵にインジェクションしたところ非常に高効率でトランジェントでのEGFPの発現が確認できた。またF0世代のスクリーニングでも20-30%の高確率でfounderが得られた。またレポーター遺伝子も、自己開裂型の2Aペプチド配列を利用して、mCherry-zCdt1-P2A-mVenus-zGemininのコンストラクトを作成した。平成30年度に、これらを組み合わせたコンストラクトの作成は終了しており、今後ライン化を行い、早急にイメージングによる解析を進めていく。一方、熱反応でvegfaやshha遺伝子の誘導可能な系統の作成では、平成30年度に、hsp:EGFPCAAX-P2A-mCherryCAAX（control）、hsp:EGFPCAAX-P2A-vegfaa、hsp:EGFPCAAX-P2A-shhaの3系統のfounderを得ることに成功した。
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| 今後の研究の推進方策 |
令和元年度には、まずは平成30年度に作成したkdrl_shortP: mCherry-zCdt1-P2A-mVenus-zGemininのライン化を行う。完成したラインでは、1系統で血管内皮特異的にFucci 2分子を同時に発現させることが可能となり、また15体節期からの観察が可能となる。これを用いて、15体節期から始まる脳血管の脈管形成過程とその後の血管新生過程での細胞周期との関連性を解析する。さらに受精後1.5日目からのPHBCを中心としたタイムラプス・イメージングも行い、血管形成過程と細胞周期との関連性を詳細に解析する。これらのイメージングはライトシート顕微鏡を用いて行うが、われわれはすでにライトシート顕微鏡を用いたゼブラフィッシュ胚のタイムラプス・イメージングに関しては、十分な経験を積んでおり、イメージング開始から48時間程度の連続した観察が可能であることも確認してある。また令和元年度には、熱反応で遺伝子誘導可能な遺伝子組み換えゼブラフィッシュを用いた細胞周期へのvegfa遺伝子やshha遺伝子の影響評価も合わせて行う。血管内皮で特異的にFucciを発現する系統とのダブル・トランスジェニック胚を用いることで、血管内皮のFucciをイメージングしながら、同時にIR-LEGO顕微鏡を用いて時間空間的に制御したvegfa遺伝子やshha遺伝子を発現誘導し、その後の細胞周期の変化をリアルタイムでイメージングにより評価する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
未使用額は455円であり、使用計画に大きな変更はない。
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