| 研究課題/領域番号 |
17K08501
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| 研究機関 | 兵庫医科大学 |
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研究代表者 |
前田 誠司 兵庫医科大学, 医学部, 准教授 (10309445)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 腎臓 / 交感神経 / 終末 / varicosity / チロシン水酸化酵素 / 腎傷害 / 虚血 |
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| 研究実績の概要 |
腎支配交感神経の機能と終末の特性を調べる目的で、ラット左腎頭側部皮質領域を支配するニューロンの椎前神経節区分である腎上神経節への蛍光遺伝子(pCAGGS-td-Tomato)の導入を行い、腎交感神経の遠心性終末の形状およびその分布について確認した。蛍光観察下において、td-Tomato陽性ニューロンは、腎動脈から弓状動脈にかけて、チロシン水酸化酵素(TH)陽性神経束として腎実質内に進入していた。皮質内では、陽性ニューロンは小葉間動脈および細動脈上に数珠状の節状終末をもち、輸入細動脈から糸球体近傍に分布し、一部の側枝は尿細管間質に達していた。これらの分布は、td-Tomato陰性TH陽性ニューロンの終末も伴っていた。これらの節状終末は終末特異的タンパク質であるシナプトフィジン陽性を示した。以上のことから、腎上神経節由来の腎遠心性ニューロンは細動脈、傍糸球体細胞、および尿細管に投射し、複数ニューロンがこれらの効果器を共同支配していることが示唆された。
一方で、腎虚血/再灌流(I/R)にともなう組織傷害への交感神経の影響を調べる目的で、腎神経温存I/Rモデル(RNP)ラットを作出し、このモデルの有効性を確認するために従来の2 kidney-1 clippingモデル(DAC)との比較を行った。両者の虚血側腎の傷害の程度に差は認められなかったが、対側腎との相対重量比ではI/R後72時間においてRNP群で値が有意に大きくなった。腎THの発現量をWestern Blotにて確認したところ、I/R直後のDAC群で虚血腎TH量が有意に高く、また対側腎THが有意に低い値となった。以上から、I/Rモデルにおいて、従来法はI/R直後に処置側の腎神経が過剰に刺激され、また対側腎にも影響を与えたと考えられる。よって腎傷害における交感神経機能の解析にはRNPモデルが有効であることが示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
初年度の計画として、腎交感神経終末の詳細観察と活性化ターゲットの決定を行う予定であった。遠心性神経側枝の終末の広がりについては、蛍光タンパク質遺伝子導入により概ね観察することができた。しかしながら、終末部構成タンパク質がシナプトフィジン以外では検出できず、それらの発現・分布について検討する必要が出てきた。よって終末ターゲット分子の同定について、腎交感神経節および神経終末での発現を検討している。
一方、遺伝子導入による腎局所的交感神経活動調節を行う予定であったが、腎上神経節への遺伝子導入効率が十分でなく、また、同一効果器に複数ニューロンの投射がみられることが明らかになった。このことはin vivoでの解析を困難にする原因となることから、in vitroにおけるターゲットへの効果の解明を優先的に行い、最終的にin vivoにおけるターゲット効果の確認を行うよう修正した。
また、I/R腎傷害モデルラットについて、RNP法に対して従来の2K1C法との違いを明確にすることが、遺伝子導入による神経抑制実験に先立ち必要と判断されたため、初年度はこれらの実験を優先的に行った。
いくつかの点について、新たに検討課題が挙がったが、概ね想定内であり、若干の計画修正により遂行していく予定である。
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| 今後の研究の推進方策 |
交感神経の腎皮質効果器への投射について、細動脈、傍糸球体細胞、そして尿細管上皮細胞への終末部特性について十分に明らかにできていない。よって、結節状終末のシナプス前膜におけるノルアドレナリン放出機序に関わる分子群の発現および形態的特性の解析を行う。免疫組織化学を用いた予備実験では、シナプス前膜に局在するとされるいくつかのアクティブゾーン(AZ)関連蛋白質の発現は確認できなかった。ラット正常腎皮質および腎支配交感神経節を用いて、RT-PCRおよびWestern blotにより標的となるAZ関連タンパク質群(Synaptoporin, SV2など)の発現を確認し、陽性を示した分子に対して、より高感度の免疫組織化学および免疫電顕を行う。これらは以下の腎傷害モデルにおける交感神経終末の変移に関する研究に用いる指標として重要である。また、効果器側の反応として、主に尿細管上皮細胞におけるアドレナリン受容体(ADR)の発現と、アゴニストを用いた受容体活性化を行い、その応答について観察する。ラット尿細管上皮細胞の培養細胞を用いた予備実験により、α1A-およびβ2-ADRの発現が確認されている。よって特異的アゴニストによるこれらの受容体刺激とその後のシグナリング経路の活性をWestern blotおよび免疫組織化学によって観察していく。
一方、I/R傷害モデルにおける交感神経の作用を明らかにするため、腎神経切除ラットの傷害の進行と修復を検討する。すなわち腎神経終末の標的分子（既述）の発現について、I/R後1週間以内のRNP群と正常対照群との比較を行い、傷害腎における交感神経活動の変移を観察する。その一方で、交感神経の切除を行ったI/Rモデル群とRNP群について、I/R処置後の組織修復過程、すなわち尿細管壊死とマクロファージ数の変移、および線維化面積と筋線維芽細胞数の変移について定量化を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
動物実験において、若干の計画修正があり、次年度使用額が発生した。次年度において、動物実験に係る費用として使用予定である。
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