| 研究課題/領域番号 |
17K08510
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| 研究機関 | 金沢大学 |
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研究代表者 |
井関 尚一 金沢大学, 医学系, 協力研究員 (50167251)
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| 研究分担者 |
仲田 浩規 金沢大学, 医学系, 講師 (80638304)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 顎下腺 / 導管系 / 細胞分化 / 性差 / ホルモン / マウス |
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| 研究実績の概要 |
C57BL6系マウスの受精卵に対してCRISPR-Cas9ゲノム編集を行い、第15染色体で顎下腺C蛋白質（SMGC）をコードするエクソン３の一部に7bpまたは5bpの遺伝子欠損を生じさせ、翻訳のフレームシフトによりSMGCの大部分が欠如するノックアウト（KO）マウスの２系統（d7-SMGCとd5-SMGC）を作成した。これらのKOマウスのホモ接合個体は特に異常なく生育し、生殖も可能であった。出生直後のマウス顎下腺導管の末端にはまだ腺房が形成されていないが、トルイジンブルーやアルシアンブルーPAS染色で染まり、電顕で暗く見える顆粒をもつ末端導管細胞（TT細胞）と、明るい顆粒をもつ前腺房細胞（プロアチナー細胞）が存在する。このうちTT細胞は顆粒中にSMGCをもち、生後３週以降に次第に数が減少し、雄では5週頃に完全に消失するが、雌では成獣に至るまで少数が導管系遠位端に存在する。TT細胞の生理的役割は不明であるが、腺房あるいは導管系の前駆細胞である可能性も指摘されている。今回のKOマウスの顎下腺においては、出生直後からTT細胞の顆粒に本来発現するSMGCは当然ながら欠如していたが、雌雄とも成獣に至るまで腺房および導管系の発育は正常であった。さらに光顕および電顕により顎下腺の形態を解析すると、KOマウスでは出生直後からトルイジンブルーやアルシアンブルーPASで染まる顆粒を持ったTT細胞そのものが欠落し、未分化な導管細胞に置き換わっていた。それにもかかわらず、明るい顆粒をもつプロアチナー細胞は存在し、そこから正常な腺房が分化することが示唆された。すなわち、マウス顎下腺においてSMGCという生理機能不明の分泌蛋白質の欠如によりTT細胞の分化そのものが停止すること、またSMGCおよびTT細胞の欠如は腺房および導管系の生後発達に影響しないこと、がわかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
当初計画では、マウスの誕生時に見られる２種類の導管系前駆細胞、すなわちSMGCで標識される細胞とK5で標識される細胞について遺伝子改変動物を作成し、生後発達における分化の道筋すなわち細胞系譜を調べることになっていた。しかし予算、設備、時間及び人員の制約から、SMGC標識前駆細胞の研究に対象を絞ることにした。当初計画ではSMGCのプロモータの下流に蛍光標識遺伝子および条件的致死遺伝子を導入したノックインマウスを作成することとしていたが、まず技術的により容易なSMGCノックアウトマウスを作成することにし、金沢大学の遺伝子改変動物分野との共同研究で進めてきた。平成29年度中にノックアウトマウス作成がほぼ完了し、平成30年度を通じて系統を維持しつつ雌雄のホモ接合個体について表現形質を探索したところ、有力な顎下腺の表現形質（TT細胞の欠如）を見出した。
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| 今後の研究の推進方策 |
今回作成したSMGCノックアウトマウスの系統を維持しつつ、発見された顎下腺の表現形質（TT細胞の欠落）についてさらに詳しく組織形態学的に解析し、論文発表にもっていく。またSMGCという分泌蛋白質及びTT細胞の欠落にもかかわらず、ノックアウトマウスで正常に腺房や導管系が分化することの理由を解明するため、ノックアウトマウスの顎下腺でSMGCの代償として発現する遺伝子産物のスクリーニングを行う。当初計画に記載したSMGCのプロモータ下流へのノックインマウスの作成は、残り１年の期間中に行うことを断念し、今回得られたノックアウトマウスの解析に専念する。従来から行ってきた、正常マウスを用いた顎下腺の性差やホルモン依存性分化に関連した遺伝子産物の研究も平行して継続する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
遺伝子改変動物の作成をSMGCノックアウトマウスに絞ったこと、また平成30年度中はマウスの系統維持と形態学的手段での表現形質解析のみを行ったこと、さらに研究代表者が平成30年度に就職した新設大学でまだ研究体制が整っていないことなどもあり、予算使用計画に余裕が生まれた。次年度は作成したマウスを系統維持しつつさらに多くの顎下腺形質について発現解析を行うため、また通常のマウスを用いた顎下腺の性差やホルモン依存性分化に関連した新たな遺伝子産物の探索を行うため、繰り越した経費を動物飼育費、抗体及び遺伝子関連製品の購入に使用する。
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